神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3基因修飾的雪旺細(xì)胞對(duì)神經(jīng)缺損的研究.pdf

1、周?chē)窠?jīng)損傷臨床療效常常不能令人滿意。近年來(lái)，雪旺細(xì)胞(Schwanncells，SCs)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用開(kāi)始引起學(xué)者們的重視。Rathbone 等在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)：SCs是周?chē)窠?jīng)基因治療理想的受體細(xì)胞，在周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)神經(jīng)損傷后，SCs 對(duì)再生軸突具有誘向作用，并有較強(qiáng)的維持神經(jīng)元存活，促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)、神經(jīng)再生的作用。并通過(guò)自分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(neurotrophic factors NTs)維持存活，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能促進(jìn)發(fā)育中的交

2、感和感覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞的分化和成熟，維持交感神經(jīng)元正常功能，促進(jìn)該神經(jīng)元突起的長(zhǎng)出，并誘導(dǎo)突起向神經(jīng)纖維生長(zhǎng)。
　　 特別是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(neurotrophic factor 3 NT-3)，能夠維持肌梭、肌腱和皮膚傳入感覺(jué)神經(jīng)元的存活，增加運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元再生，促進(jìn)神經(jīng)肌突觸的成熟，增加再生軸突的數(shù)量和長(zhǎng)度，防止神經(jīng)損傷后肌肉萎縮。在周?chē)窠?jīng)損傷再生過(guò)程中有非常重要作用。但NT-3在體內(nèi)不穩(wěn)定，極易被稀釋或降解失活，吸收率不高，在臨床應(yīng)

3、用上效能較低。SCs 有時(shí)效局限。本實(shí)驗(yàn)為了提高NT-3和雪旺細(xì)胞促進(jìn)神經(jīng)再生的活性、減少局限性，將NT-3基因轉(zhuǎn)入雪旺細(xì)胞，觀察其表達(dá)。為了初步探討其作用，故設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)。
　　 首先我們培養(yǎng)、分離、純化雪旺細(xì)胞。先將出生后3d的Wistar大鼠坐骨神經(jīng)，經(jīng)雙酶消化后的剩余組織塊采用植塊法培養(yǎng)雪旺細(xì)胞，混懸于DMEM 培養(yǎng)液中，接種于培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱。3ｄ后首次換液，以后7ｄ換液1 次。細(xì)胞80[％]融合時(shí)，雙差速貼壁法G-

4、418(geneticin)純化雪旺細(xì)胞。然后再培養(yǎng)24h。
　　 相差顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，繪制各自的增殖曲線。在不同時(shí)間對(duì)雪旺細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析、免疫組化S-100蛋白染色鑒定、四氮唑鹽(MTT)比色法測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：胰酶和膠原酶混合消化后的雪旺細(xì)胞活細(xì)胞率為94.6±3.4[％]，經(jīng)免疫組化S-100 法鑒定純化后的雪旺細(xì)胞純度為95.6±2.5[％]。
　　 差異有非常顯著性意義(P<0.01)。

5、說(shuō)明周?chē)窠?jīng)中存在大量雪旺細(xì)胞，這些細(xì)胞能在體外進(jìn)行分離培養(yǎng)，能獲取量大純度高、活力良好的雪旺細(xì)胞。胰酶和膠原酶混合消化結(jié)合差速貼壁法和G418 純化，可得到較高純度和較多數(shù)量的雪旺細(xì)胞。這是一種簡(jiǎn)便有效的雪旺細(xì)胞培養(yǎng)、純化的方法。
　　 在第二部分，我們先將NT-3 質(zhì)粒提取、鑒定和純化；采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介入法，將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染酶介導(dǎo)的NT-3 轉(zhuǎn)染至已培養(yǎng)好的雪旺細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的雪旺細(xì)胞經(jīng)G418 篩選，獲得成功轉(zhuǎn)染NT-3基因的

6、SCs 克隆。觀察NT-3蛋白的表達(dá)，鏡下測(cè)定轉(zhuǎn)染率，收集不同階段的無(wú)血清培養(yǎng)液，通過(guò)免疫組化和RT-PCR 結(jié)果測(cè)定樣本中NT-3 含量。采用免疫組化和逆轉(zhuǎn)錄酶-多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法進(jìn)行鑒定，并對(duì)RT-PCR 產(chǎn)物測(cè)序，進(jìn)一步證實(shí)NT-3的存在；用限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒后瓊脂糖電泳鑒定；ELISA 雙抗體夾心法檢測(cè)NT-3的表達(dá)；經(jīng)過(guò)G418的多次篩選，并經(jīng)Gimsa 染色、免疫組化S-100 法鑒定SCs的純度。結(jié)果顯示：

7、
　　 經(jīng)Gimsa 染色、免疫組化S-100 法鑒定SCs的純度達(dá)95％以上。轉(zhuǎn)染后雪旺細(xì)胞最突出的表現(xiàn)是胞體多呈長(zhǎng)梭形，胞漿豐富，核卵圓形，可見(jiàn)到豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和發(fā)育良好的高爾基體。ELISA 雙抗體夾心法測(cè)定轉(zhuǎn)染后不同時(shí)期的NT-3的濃度：1周開(kāi)始表達(dá)，2周后表達(dá)增加，4周后明顯增加，差異有非常顯著性意義(P<0.01)。所以，NT-3基因可轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的SCs 并高效表達(dá)。SCs作為受體細(xì)胞，易于獲取并能在體外大量

8、培養(yǎng)繁殖；能較長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)所攜帶基因而不衰減，并能穩(wěn)定大量地表達(dá)。
　　 為了進(jìn)一步探討神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3基因修飾的雪旺細(xì)胞對(duì)周?chē)窠?jīng)再生修復(fù)的影響，從轉(zhuǎn)基因角度探討治療周?chē)窠?jīng)損傷的有效方法，我們?cè)诘谌糠衷O(shè)計(jì)NT-3基因修飾的雪旺細(xì)胞修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損觀察其對(duì)促進(jìn)神經(jīng)再生的影響。我們選用96 只SD大鼠，于右側(cè)梨狀肌下緣以遠(yuǎn)8mm切斷并切除遠(yuǎn)斷端10mm長(zhǎng)的神經(jīng)干保持10mm的缺損，制成坐骨神經(jīng)缺損模型，應(yīng)用NT-3基因修飾的雪

9、旺細(xì)胞結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)凝膠及生物可降解聚乳酸聚羥基乙酸共聚物管(PLGA)構(gòu)建的神經(jīng)移植復(fù)合體，修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)的缺損。將坐骨神經(jīng)切斷缺損模型大鼠按橋接物的不同隨機(jī)分為4組，每組24 只。A組：細(xì)胞外基質(zhì)凝膠PLGA 管橋接組；B組：雪旺細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)凝膠PLGA 管橋接組；C組：NT-3基因-細(xì)胞外基質(zhì)凝膠PLGA 管橋接組；D組：NT-3基因修飾的雪旺細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)凝膠PLGA 管橋接組。術(shù)后1周、4周、8周、12周進(jìn)行運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳

10、導(dǎo)速度、軸突數(shù)、髓鞘的厚度、神經(jīng)纖維的直徑、神經(jīng)組織面積的百分比和坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(sciatic nerve functional index SFI)等檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)D組均優(yōu)于B、C組，B、C組均優(yōu)于A組(P<0.01)，而B(niǎo)、C組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。因此，轉(zhuǎn)染NT-3基因的雪旺細(xì)胞移植于損傷的周?chē)窠?jīng)，有促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)、髓鞘再生的作用，使局部釋放的NT-3 加快軸突再生速度以促進(jìn)周?chē)窠?jīng)再生，減緩失神經(jīng)支配肌肉的萎縮，能彌補(bǔ)

11、單純細(xì)胞移植、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子含量的不足。
　　 綜合我們的試驗(yàn)，結(jié)合參閱文獻(xiàn)，我們認(rèn)為：(1)胰酶和膠原酶混合消化結(jié)合差速貼壁法和G418 純化，可得到較高純度和較多數(shù)量的雪旺細(xì)胞。這是一種簡(jiǎn)便有效的雪旺細(xì)胞培養(yǎng)、純化的方法。(2)NT-3基因可轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的SCs 并高效表達(dá)。SCs作為受體細(xì)胞，易于獲取并能在體外大量培養(yǎng)繁殖；能較長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)所攜帶基因而不衰減，并能穩(wěn)定大量地表達(dá)。(3)轉(zhuǎn)染NT-3基因的雪旺細(xì)胞移植于損傷的周?chē)窠?jīng)