慢病毒介導人神經(jīng)營養(yǎng)素-3基因修飾的神經(jīng)干細胞移植治療大鼠腦缺血的實驗研究.pdf

1、研究背景和目的：中風是一類嚴重影響人類健康的疾病，尤其是缺血性腦血管病(ischemiccerebrovasculardisease，ICD)，造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)大量神經(jīng)細胞缺失及神經(jīng)網(wǎng)絡受損，導致患者長期神經(jīng)功能障礙。目前治療缺血性中風的方法，臨床上療效比較確切的，只有超早期血管內(nèi)治療的方法，通過恢復腦血流來挽救缺血區(qū)瀕臨死亡的細胞。由于中風發(fā)生后神經(jīng)細胞死亡進展迅速，大腦的再生能力相當有限，使得中風及相關問題的處理相當困難。基因治療和

2、干細胞移植，是近年來有關中風治療研究的兩個主要途徑，旨在防止或減少缺血后神經(jīng)細胞死亡的發(fā)生，以及刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性神經(jīng)干細胞(neuralstemcells，NSCs)增殖，或直接發(fā)揮“細胞替代”作用，為ICD的治療帶來一線希望。 然而，中風發(fā)生后，內(nèi)源性神經(jīng)干細胞對腦組織修復的促進作用非常有限。有研究表明，大約80％新增殖的內(nèi)源性神經(jīng)干細胞會在6周內(nèi)死亡，僅有0.2％的細胞缺失能得以替代。干細胞移植(包括神經(jīng)干細胞胞、骨髓

3、間充質干細胞等)后，一定程度上能改善腦缺血動物的神經(jīng)功能，但是，其機理不十分明確。到現(xiàn)在止，多數(shù)研究者認為，干細胞移植是通過所謂的“bystandermechanism”而非直接“細胞替代”而發(fā)揮治療作用。近年來，干細胞治療腦血管病的研究的重點已轉向刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖并防止其凋亡的方向上來。特別是神經(jīng)干細胞已經(jīng)被用作基因治療的載體，可將治療基因攜帶到病灶，通過治療基因在缺血性損傷局部表達，來改變神經(jīng)干細胞巢所處的微環(huán)

4、境，即通過對所謂“bystandermechanism”機制的放大作用，來對內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖、分化及存活進行調控，有望為中風的治療帶來新的希望。 本課題研究目的是探討人神經(jīng)營養(yǎng)素-3(humanneurotrophin-3，hNT-3)基因修飾的神經(jīng)干細胞移植后，對缺血性腦損傷大鼠海馬齒狀回(dentategyrus，DG)和紋狀體半暗帶內(nèi)源性神經(jīng)前體細胞的增殖與分化的影響，以及對神經(jīng)功能改善的治療作用，探討其可能的治療機

5、制，為腦缺血的干細胞治療尋找新途徑。 方法： 實驗共分三部分。第一部分：從孕14天Sprague-Dawley(S-D)大鼠胚胎的腦組織分離出神經(jīng)干細胞，采用無血清培養(yǎng)法，進行體外培養(yǎng)、擴增，并通過免疫熒光化學染色(巢蛋白)進行鑒定。取傳至第5～6代神經(jīng)干細胞，以1×105個細胞/500μl/孔接種于24孔板，分別按復感染指數(shù)(Multiplicitiesofinfection，MOIs值)為0、1、5、10、15、20

6、加入攜帶報告基因GFP的慢病毒載體(lentiviralvector-GFP，LV/GFP)稀釋液，每一滴度加六孔，共六組。2～3天后于倒置熒光顯微鏡下觀察各組GFP的表達效率，并在3天后進行神經(jīng)干細胞球進行計數(shù)，觀察LV/GFP對NSCs增殖的影響。并行流式細胞儀檢測，得出各組NSCs的GFP陽性轉染率。第二部分：重組表達hNT-3基因的載體質粒(pGC-E1/hNT3)，并與2種輔助質粒(pHelper1.0和pHelper2.0)

7、在包裝細胞293T內(nèi)應用Lipofectamine重組，構建成表達hNT3的慢病毒載體(lentiviralvector-hNT3，LV/hNT3)。并通過RT-PCR和Western-blot檢測病毒載體的生物學活性。第三部分：雄性S-D大鼠建立腦缺血再灌注腦損傷模型，并隨機分為三組。實驗組用LV/hNT3轉染5～6代NSCs，并在術后第七天，將NSCs-hNT3移植到大鼠紋狀體半暗帶。對照組移植普通NSCs或生理鹽水。各組大鼠在細胞

8、移植前后的不同時期進行運動功能和行為學檢測評分，并取樣檢測細胞移植點NT-3及其受體TRKC的表達水平。應用免疫熒光染色方法對細胞移植2周后內(nèi)源性神經(jīng)前體細胞的增殖與分化進行檢測。 結果 第一部分：NSCs以懸浮細胞球方式生長，nestin染色陽性。轉染GFP基因后，除MOI值為0的對照組外，2～3天后各孔均有GFP表達。MOI值從0增至10，細胞的陽性表達率逐漸提高(P＜0.05)，MOI值為10的組能獲得＞90％的轉

9、染率。但MOI值從10增至20，形成的神經(jīng)干細胞球數(shù)目卻逐漸減少(P＜0.05)。第二部分：細胞轉染hNT-3基因2～3天后，細胞提取物RT-PCR檢測陽性，陽性克隆基因測序比對證實載體構建正確，Western-blot檢測進一步證實病毒載體轉染轉染細胞后具有生物學活性。第三部分：與對照組比較，hNT-3基因修飾的NSCs移植后能在缺血區(qū)遷移，在移植點能分泌較高水平的hNT-3蛋白(P＜0.001)，并且TRKC基因表達水平增加(P＜0

10、.01)。移植hNT-3基因修飾的NSCs，能增加缺血性腦損傷大鼠海馬齒狀回和紋狀體半暗帶的內(nèi)源性神經(jīng)前體細胞增殖(BrdU+)和向神經(jīng)元方向分化(DCX+)(P＜0.05)，并能促進大鼠神經(jīng)功能(NSS評分)的改善(P＜0.05)。 結論： (1)LV是將外源基因轉入神經(jīng)干細胞的理想載體。以MOI為10的滴度，LV可將外源基因高效轉入神經(jīng)干細胞內(nèi)。(2)慢病毒介導轉染神經(jīng)營養(yǎng)素-3基因的神經(jīng)干細胞移植后，能在缺血腦組織