肽基凝膠誘導(dǎo)NT-3基因修飾BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化研究.pdf

1、研究目的：
　　構(gòu)建體外脊髓組織工程模塊，探討在含IKVAV肽基凝膠三維培養(yǎng)下，NT-3基因修飾的BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化情況。
　　研究方法：
　　1、采用全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞術(shù)表面抗原檢測、觀察其向成脂方向誘導(dǎo)分化，CCK-8繪制細(xì)胞生長曲線。
　　2、使用NT-3過表達(dá)腺病毒（Ad-NT-3-RFP）對BMSCs進(jìn)行基因修飾，48h后熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記蛋白RFP在轉(zhuǎn)染后BM

2、SCs中表達(dá)情況，ELISA法檢測修飾后BMSCs NT-3蛋白表達(dá)情況。
　　3、通過含細(xì)胞的培養(yǎng)液促發(fā)多肽溶液自組裝形成三維培養(yǎng)體系，實(shí)驗(yàn)分成三組：凝膠-NT3組（經(jīng)NT-3病毒轉(zhuǎn)染后三維培養(yǎng)）、凝膠-RFP組（經(jīng)RFP對照病毒轉(zhuǎn)染后三維培養(yǎng)）、NT-3組（只經(jīng)NT-3病毒轉(zhuǎn)染）。運(yùn)用qRT-PCR及Western blot檢測各組BMSCs細(xì)胞中MAP-2、GFAP mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果：
　　

3、1、分離獲取的BMSCs呈梭行，流式細(xì)胞測定顯示細(xì)胞高表達(dá)CD29，不表達(dá)CD34，經(jīng)成脂誘導(dǎo)2周出現(xiàn)脂滴，油紅O染色成紅色。
　　2、使用Ad-NT-3-RFP轉(zhuǎn)染BMSCs48h后，細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的RFP表達(dá)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均在90％以上。ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中NT-3含量，細(xì)胞液中第1天就開始出現(xiàn)NT-3蛋白，第3天NT-3蛋白濃度明顯升高。到第5天后，每天培養(yǎng)液中NT-3蛋白濃度未出現(xiàn)明顯差異。
　　3、qRT-P