GDNF和NT-3雙基因誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分SD大鼠BMSCs的培養(yǎng)和鑒定
　　目的:建立體外培養(yǎng)擴(kuò)增、檢測(cè)鑒定SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的方法,觀察其生物學(xué)特性;
　　方法:采取全骨髓培養(yǎng)法分離和純化大鼠BMSCs,用顯微鏡觀察細(xì)胞形體,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞純度,觀察BMSCs在誘導(dǎo)條件下向成骨細(xì)胞分化的能力;
　　結(jié)果:全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)的BMSCs具有良好的貼壁性,流式細(xì)胞儀檢測(cè):CD44(96.49％)、CD90(95.63%)、CD4

2、5(0.64%)、CD34(0.39%);第3代細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)可向成骨細(xì)胞分化;
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)用全貼壁篩選法培養(yǎng)出高純度的BMSCs,增殖穩(wěn)定,在條件誘導(dǎo)下具有多分化的潛能。
　　第二部分GDNF、NT-3雙基因轉(zhuǎn)染促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化
　　目的:利用GDNF和NT-3雙基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞,為其治療神經(jīng)性疾病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ);
　　方法:全骨髓法分

3、離培養(yǎng)BMSCs,流式細(xì)胞術(shù)及成骨誘導(dǎo)預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BMSCs純度及特性。轉(zhuǎn)染GDNF和NT-3雙基因后,在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化;利用RT-PCR和免疫熒光檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物表達(dá);
　　結(jié)果:BMSCs能在體外成功分離培養(yǎng),誘導(dǎo)分化后,BMSCs胞體變圓,伸出明顯突起,并可見多數(shù)細(xì)胞相互交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),呈神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)。RT-PCR檢測(cè)GDNF、NT-3、NSE、nestin、MAP-2基因表達(dá),免疫熒光標(biāo)記檢測(cè)可見表達(dá)MA

4、P-2和GFAP;
　　結(jié)論:GDNF和NT-3雙基因修飾誘導(dǎo)的BMSCs可分化為神經(jīng)樣細(xì)胞,并表達(dá)神經(jīng)元的標(biāo)志,為基因治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病如先天性巨結(jié)腸提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第三部分BMSCs分化前后電生理特性的變化
　　目的:本研究利用膜片鉗技術(shù),比較MSCs及誘導(dǎo)后神經(jīng)樣細(xì)胞之間通道電流的情況,進(jìn)一步確認(rèn)分化后神經(jīng)樣細(xì)胞的電生理功能,將為腸神經(jīng)系統(tǒng)缺如疾病的治療提供前期工作基礎(chǔ)。
　　方法:應(yīng)用膜片鉗技術(shù),采用全

5、細(xì)胞記錄方式,對(duì)由GDNF和NT-3雙基因誘導(dǎo)的分化前BMSCs和分化后的神經(jīng)樣細(xì)胞進(jìn)行電生理功能檢測(cè);
　　結(jié)果:分化前記錄到延遲整流樣鉀電流(IKDR)在+60mV時(shí)電流大小為583.6536±74.75945pA,電流密度為10.25393±1.313413pA/pF;鈣激活鉀通道電流(IKCa)在+60mV時(shí)記錄到電流峰值為370.775±49.57507pA,電流密度為6.513967±0.87096pA/pF;瞬時(shí)外向

6、鉀通道電流(Ito)在+60mV時(shí)電流峰值為467.03±68.44461pA,電流密度為8.205025±1.20247pA/pF;分化后IKDR在+60mV時(shí)電流大小為850.32±53.5708pA,電流密度為18.72207±1.578505pA/pF;IKCa在+60mV時(shí)電流峰值為452.6455±13.4805pA,電流密度為8.058586±0.943178pA/pF;Ito電流峰值為621.194±66.039pA,電

7、流密度為15.00152±1.918339pA/pF;分化前BMSCs的IKDR和分化后神經(jīng)樣細(xì)胞的IKDR在+60mV時(shí)電流峰值相比較具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=2.721,P值=0.015);分化前IKDRBMSCs電流密度和分化后神經(jīng)樣細(xì)胞IKDR電流密度相比較亦具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=2.441,P值=0.030);
　　結(jié)論:大鼠骨髓BMSCs誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞初步具有神經(jīng)元的電生理特性,是BMSCs由神經(jīng)前體細(xì)胞向