GDNF與NT-3雙基因修飾的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療先天性巨結(jié)腸的初步研究.pdf

1、第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)
　　 目的：建立一種簡便、可靠的Sprague-Dawley(SD)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)體外分離培養(yǎng)的方法。
　　 方法：單純貼壁法分離培養(yǎng) SD 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長形態(tài)，噻唑藍(lán)(MTT)法測定細(xì)胞生長曲線，免疫組化法檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志抗原CD90、CD44和造血干細(xì)胞標(biāo)志抗原CD45的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：培養(yǎng)的BMSCs

2、為多角形或梭形，大小均一，呈漩渦狀排列生長。免疫組化檢測顯示培養(yǎng)細(xì)胞高表達(dá)BMSCs 干細(xì)胞標(biāo)志抗原CD90、CD44，而不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志抗原CD45.
　　 結(jié)論：單純貼壁法可有效分離、培養(yǎng)和純化大鼠BMSCs，為其組織工程的臨床研究應(yīng)用提供了實驗基礎(chǔ)。
　　 第二部分 SD 大鼠試驗性巨結(jié)腸模型的建立和鑒定
　　 目的：建立一種大鼠巨結(jié)腸實驗動物模型，為臨床開展干細(xì)胞移植提供實驗基礎(chǔ)。
　　 方法

3、：200±15g重SD 大鼠110只,隨機(jī)分為兩組。模型組用5mL/L-1的苯扎氯銨(BAC)經(jīng)肛處理大鼠結(jié)腸45min，對照組用生理鹽水。于術(shù)后1、2、4、8周行大體觀察、結(jié)腸測壓、取處理段結(jié)腸行HE染色、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）和蛋白基因產(chǎn)物9.5（PGP9.5）免疫熒光染色以及乙酰膽堿酯酶（AchE）組織化學(xué)染色觀察，RT-PCR檢測AchE、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）、神經(jīng)營養(yǎng)素3（NT-3）的表達(dá)情況。

4、　　 結(jié)果：術(shù)后一周實驗組大鼠逐漸出現(xiàn)腹脹，排便減少，解剖發(fā)現(xiàn)處理段腸管痙攣狹窄，上端腸管腸內(nèi)容物潴留，反射性收縮消失，組織學(xué)檢查顯示腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞消失，且Real-Time PCR也證明AchE、GDNF、NT-3的表達(dá)明顯下調(diào)。對照組則無明顯改變。
　　 結(jié)論：經(jīng)肛應(yīng)用5mL/L-1BAC的方法成功建立了無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腸段的大鼠實驗?zāi)Ｐ?，且該模型穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，為深入研究先天性巨結(jié)腸的病理生理提供了一個可靠的模型基礎(chǔ)。<

5、br>　　 第三部分 GDNF和FNT-3 雙基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 目的：構(gòu)建GDNF和NT-3 雙基因共表達(dá)的真核表達(dá)載體。
　　 方法：從新生大鼠腦組織中采用逆轉(zhuǎn)錄PCR方法擴(kuò)增GDNF和NT-3基因序列，將擴(kuò)增產(chǎn)物分別克隆到pEGFP-N1載體，然后雙酶切各pEGFP-N1載體，回收目的基因片段，將目的基因片段克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1中，構(gòu)建其真核表達(dá)載體pEGFP-EGFP-GDNF-NT-3

6、，并對重組體進(jìn)行酶切及測序鑒定。
　　 結(jié)果：PCR擴(kuò)增片段與預(yù)期結(jié)果一致，GDNF-NT-3 共表達(dá)載體構(gòu)建成功，雙酶切和測序結(jié)果正確。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了pEGFP-EGFP-GDNF-NT-3 雙基因共表達(dá)真核表達(dá)質(zhì)粒載體。
　　 第四部分 pEGFP-EGFP-GDNF-NT-3 真核表達(dá)載體在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)及成神經(jīng)誘導(dǎo)
　　 目的：探討重組體pEGFP-EGFP-GDNF-NT-

7、3 雙基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞后的表達(dá)以及誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的可行性。
　　 方法：全骨髓法分離培養(yǎng)BMSCs，流式細(xì)胞術(shù)檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志CD90和造血干細(xì)胞標(biāo)志CD45。轉(zhuǎn)染帶熒光的GDNF和NT-3基因，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)及細(xì)胞的形態(tài)變化；免疫熒光檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、神經(jīng)絲蛋白（NF）和神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)；Western blot 檢測細(xì)胞GDNF

8、及NT-3 蛋白表達(dá)。對照組為未轉(zhuǎn)染GDNF和NT-3基因的BMSCs。
　　 結(jié)果：BMSCs能在體外成功分離培養(yǎng)，細(xì)胞高表達(dá)CD90 （92.7％），不表達(dá)CD45。誘導(dǎo)分化后，BMSCs胞體變圓,伸出明顯突起，并可見多數(shù)細(xì)胞相互交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，呈神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)。免疫熒光標(biāo)記檢測可見實驗組細(xì)胞表達(dá)NSE和NF，而不表達(dá)GFAP。而對照組陰性。Western blot檢測可見細(xì)胞GDNF及NT-3蛋白表達(dá)增強(qiáng)。
　　

9、結(jié)論：研究表明重組質(zhì)粒pEGFP-EGFP-GDNF-NT-3 轉(zhuǎn)染后可在BMSCs中成功表達(dá)，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后的BMSCs可分化為神經(jīng)樣細(xì)胞并表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志。該研究為基因治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了實驗基礎(chǔ)。
　　 第五部分共表達(dá)GDNF和NT-3基因的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向腸神經(jīng)樣細(xì)胞分化的研究
　　 目的：初步研究大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)體外誘導(dǎo)分化為腸神經(jīng)樣細(xì)胞以治療先天性巨結(jié)腸的可行性。
　　 方法：

10、體外分離培養(yǎng)BMSCs,流式細(xì)胞術(shù)方法檢測CD90和CD45的表達(dá)，傳代至第五代進(jìn)行誘導(dǎo)分化。實驗組采用NanoJuice轉(zhuǎn)染試劑將目的基因膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）和神經(jīng)營養(yǎng)素3(NT-3)共轉(zhuǎn)染至BMSCs 內(nèi)，并聯(lián)合胎腸培養(yǎng)基(FGCM)誘導(dǎo)，設(shè)陽性對照組（單純轉(zhuǎn)染pEGFP-GDNF-NT-3）和陰性對照組（未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的BMSCs），免疫熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染及表達(dá)情況，免疫熒光鑒定細(xì)胞的神經(jīng)特異性烯醇化酶(NSE)、蛋白

11、基因產(chǎn)物9.5（PGP9.5）、血管活性腸肽(VIP)、一氧化氮合酶(nNOS)及神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)，RT-PCR檢測目的基因表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：體外成功培養(yǎng)及純化BMSCs，流式細(xì)胞術(shù)檢測高表達(dá)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志CD90，而不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志CD45。轉(zhuǎn)染后24h即可在免疫熒光顯微鏡下觀察到GFP表達(dá)，G418篩選4周后，細(xì)胞形態(tài)呈神經(jīng)元樣改變，免疫熒光實驗組可見NSE、PGP9.5、VIP及nNOS陽

12、性表達(dá)，GFAP陰性，陽性對照組亦有NSE陽性表達(dá)，而PGP9.5、VIP、nNOS及GFAP陰性，兩組的陽性率有統(tǒng)計學(xué)差異，陰性對照組未見表達(dá)。RT-PCR顯示目的基因在BMSCs內(nèi)成功表達(dá)。
　　 結(jié)論：GDNF和NT-3雙基因修飾聯(lián)合FGCM誘導(dǎo)的BMSCs可分化為腸神經(jīng)細(xì)胞并表達(dá)腸神經(jīng)標(biāo)志，為相關(guān)腸神經(jīng)系統(tǒng)疾病如先天性巨結(jié)腸的基因治療提供了實驗基礎(chǔ)。
　　 第六部分雙基因修飾的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療實驗性巨

13、結(jié)腸的初步研究
　　 目的：研究GDNF和NT-3 雙基因修飾的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植實驗性巨結(jié)腸大鼠模型腸壁的存活和基因表達(dá)情況，探討雙基因修飾的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療實驗性巨結(jié)腸的可行性。
　　 方法：體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并采用共表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)營養(yǎng)素3基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。將雙基因修飾的細(xì)胞移植入實驗性巨結(jié)腸模型鼠去神經(jīng)支配腸段腸壁。分別于術(shù)后1、2、4

14、、8周行大體觀察、病理學(xué)檢測、免疫熒光檢測PGP9.5、VIP的表達(dá)；real-time PCR檢測GDNF、NT-3 及RET mRNA的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：1.采用貼壁法成功分離培養(yǎng)和純化了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。2.通過基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可誘導(dǎo)分化為腸神經(jīng)樣細(xì)胞。3.運(yùn)用0.5％BAC 處理大鼠結(jié)腸后一周，病理學(xué)檢查可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后1、2、4周后免疫熒光檢測可見PGP9.5、VIP 陽性的神經(jīng)