2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、帕金森病(PD)是常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,其基本的臨床癥狀包括靜止性震顫、僵硬、運動遲緩和姿勢異常等。由于PD是一種逐漸進展的變性疾病,常導致多種運動障礙,且患病人數(shù)逐年增加,因此對社會和經(jīng)濟影響已經(jīng)越來越大。其主要病理變化是黑質多巴胺(DA)能神經(jīng)元的變性,結果導致紋狀體內DA及其代謝產(chǎn)物3,4-二羥基苯乙酸(DOPAC)含量明顯減少。目前治療PD的主要方法有藥物治療、手術治療、細胞移植和基因治療。藥物和手術治療對PD起到緩解癥狀的

2、作用,不能延緩或阻止疾病進程。細胞移植治療通過移植細胞替代損失的DA能神經(jīng)元以恢復黑質多巴胺的神經(jīng)傳遞,雖有效果但不持久。目前認為:理想的PD治療方法應該不僅能糾正腦內DA含量的不足,而且能保護殘留的DA能神經(jīng)元,基因治療是實現(xiàn)這一目標的最佳途徑之一,已成為PD治療的研究熱點。
   基因治療通過把目的基因轉染到細胞內再進行腦內移植或者通過質粒或病毒載體直接把目的基因轉染到腦內病變部位。骨髓間充質干細胞(BMSCs)因來源豐富,

3、取材簡便,在體外易于培養(yǎng)和擴增,且自體移植克服了免疫排斥和倫理道德等特點,而成為理想的載體細胞。常用的外源基因主要包括促進DA合成的酶類如酪氨酸羥化酶(TH)、各種神經(jīng)營養(yǎng)因子基因及抗凋亡基因等。其中TH是DA合成過程中的限速酶,是神經(jīng)系統(tǒng)內DA能神經(jīng)元的蛋白標志。研究發(fā)現(xiàn)把外源性的TH基因導入PD模型大鼠紋狀體內,可增加腦內DA的水平,改善阿撲嗎啡(APO)誘導的旋轉癥狀,對PD有治療作用。
   Neurturin(NTN)

4、在結構和功能上與膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)有關,二者同屬于GDNF亞家族,對DA能神經(jīng)元具有特異性的營養(yǎng)、支持、保護和損傷修復作用。研究證實NTN在體內外都能促進胚胎中腦神經(jīng)元的存活,阻止神經(jīng)退行性病變的發(fā)生,是治療PD的一種有效的神經(jīng)保護因子。
   研究發(fā)現(xiàn)將TH或NTN基因修飾的細胞分別移植到PD大鼠腦內,均能明顯改善PD大鼠的行為、提高紋狀體內DA含量。但進一步研究發(fā)現(xiàn)單基因不足以維持DA水平及癥狀的持續(xù)改善,

5、目前研究趨向于多基因共轉染的治療方法;研究發(fā)現(xiàn)與單轉染TH組相比,將TH與AADC(芳香族氨基酸脫羧酶,DA合成過程中一種重要的酶)共轉染PD大鼠紋狀體后行為學改變較明顯,且不依賴外源性四氫喋呤(BH4),而單轉染TH組只有在外源性四氫喋呤(BH4)存在時才可檢測到DA。本研究將TH和NTN結合起來進行基因治療,設想此方法既可增加腦內DA的合成,同時又能保護DA能神經(jīng)元,二者協(xié)同作用以達到雙重治療效果。而目前將TH和NTN雙基因共轉染B

6、MSCs腦內移植治療PD的研究國內外尚未見報道。
   本研究首先利用密度梯度離心法對BMSCs進行體外分離、培養(yǎng)與擴增,研究其生物學特性、增殖情況以及相關特異性抗原的表達,以證實所培養(yǎng)的細胞為BMSCs:隨后利用含有兩個多克隆位點pIRES質粒,將TH和NTN基因串聯(lián)起來的,構建TH和NTN雙基因表達載體并轉染到BMSCs中,獲得穩(wěn)定攜帶pIRES-TH-NTN的BMSCs,并測定TH-NTN-BMSCs中TH和NTN mRN

7、A和蛋白的表達;最后將TH-NTN-BMSCs移植到PD大鼠紋狀體區(qū),觀察對PD模型大鼠的治療作用,并通過多種手段對移植前后PD大鼠行為學、特異性神經(jīng)遞質、組織學以及相關基因與蛋白進行比較分析,為PD的基因治療探索一種新的有效的方法。本研究分為以下三個部分:
   第一部分大鼠骨髓間充質干細胞的體外培養(yǎng)及生物學鑒定
   方法:
   1.無菌條件下獲取大鼠骨髓,密度梯度離心法分離BMSCs,進行原代培養(yǎng)。

8、>   2.BMSCs傳代培養(yǎng),采用MTT法測定其生長活性。
   3.利用流式細胞技術和免疫細胞化學染色測定CD34和CD29分子的表達。
   結果:
   1.接種后24h內,體積較大的圓型細胞開始貼壁生長:2~3d后細胞大部分貼壁,開始大量伸展:數(shù)天后,細胞增殖旺盛,從形態(tài)學上判斷為BMSCs。
   2.傳代后細胞生長迅速,生長活性測定結果顯示隨著培養(yǎng)時間的推移,吸光度值逐漸增加,在培養(yǎng)第6~

9、11d時,細胞增殖最為迅速。
   3.流式檢測CD34陽性率僅為2.40%,而CD29陽性率高達93.93%,免疫細胞化學檢測CD29呈陽性,CD34呈陰性表達,利用排除法確定培養(yǎng)細胞為BMSCs。
   第二部分 TH-NTN雙基因表達載體的構建及體外表達
   方法:
   1.利用pMD18T-TH和pcDNA-NTN質粒獲取TH和NTN基因,構建pIRES-TH-NTN載體,并進行酶切及基因測序

10、鑒定。
   2.利用脂質體2000將pIRES-TH-NTN載體轉染到BMSCs中,并利用G418進行篩選。
   3.利用RT-PCR技術檢測TH-NTN-BMSCs中TH和NTN mRNA的表達。
   4.利用酶聯(lián)免疫吸附法測定轉染24h、36h、48h及72h后,TH-NTN-BMSCs中TH和NTN蛋白的表達。
   結果:
   1.酶切及基因測序結果表明成功構建pIRES-TH-N

11、TN載體。
   2.轉染及G418篩選后,獲得穩(wěn)定攜帶pIREs-TH-NTN的BMSCs。
   3.TH和NTN mRNA在TH-NTN-BMSCs中的表達高于BMSCs。
   4.TH-NTN-BMSCs中TH和NTN蛋白表達高于BMSCs;
   第三部分 TH-NTN基因修飾的骨髓間充質干細胞對帕金森病模型大鼠的治療作用
   方法:
   1.采用兩點注射法,大鼠右側黑質注

12、射6-羥基多巴胺(6-OHDA)致單側損毀,制備PD動物模型,大鼠隨機分為對照組和模型組。
   2.術后2、4、6、8w大鼠腹腔注射APO0.5mg/kg,對模型大鼠進行行為學測試。
   3.成功模型大鼠分為PD組(未移植組)、BMSCs組(移植BMSCs)和TH-NTN組(移植TH-NTN-BMSCs),利用微量進樣器將BMSCs和TH-NTN-BMSCs移植到PD模型大鼠右側紋狀體,移植前對移植細胞進行5-溴脫氧

13、尿嘧啶(BrdU)標記。
   4.移植2、4、6、8w后對各組大鼠注射APO,并記錄30min內旋轉圈數(shù)。
   5.采用高效液相-電化學法(HPLC-EC)檢測PD組大鼠左右側及移植后各組大鼠右側紋狀體區(qū)組織勻漿液DA及DOPAC含量。
   6.采用免疫組化法測定PD組大鼠左右側黑質區(qū)TH及移植后各組大鼠右側紋狀體區(qū)TH和NTN表達。
   7.采用RT-PCR和Western blotting測定

14、移植后不同時間點各組大鼠右側紋狀體區(qū)TH和NTN mRNA和蛋白含量。
   結果:
   1.大鼠右側黑質注射6-OHDA2w后,開始出現(xiàn)少動、豎毛、行動遲緩,躬身等異常表現(xiàn),注射APO后,對照組始終無恒定旋轉行為,模型組大鼠出現(xiàn)健側單向旋轉行為,連續(xù)記錄30min的旋轉圈數(shù)作為PD動物行為學評價指標。旋轉圈數(shù)超過7r/min視為成功模型,成功模型大鼠達到84只(占73.68%)。
   2.移植后各組大鼠行為

15、學觀察可見,BMSCs組及TH-NTN組大鼠較PD組自主活動增加,TH-NTN組大鼠表現(xiàn)更為明顯。APO誘發(fā)下2w、4w、6w及8wTH-NTN組較PD組和4w、6w及8w時較BMSCs組30min內旋轉圈數(shù)顯著減少,有統(tǒng)計學意義。
   3.PD組大鼠右側紋狀體區(qū)DA及DOPAC含量較對側顯著降低,其中,8w時DA含量較對側降低約76.30%,DOPAC含量較對側降低82.79%。
   4.2w、4w、6w及8w T

16、H-NTN組較PD組和4w、6w及8w時較BMSCs組大鼠右側紋狀體區(qū)DA和DOPAC含量均顯著升高,有統(tǒng)計學意義。
   5.免疫組化結果顯示PD組大鼠損毀側(右側)黑質缺乏TH陽性細胞,而對側存在明顯的TH陽性細胞。
   6.免疫組化結果顯示移植后細胞在腦內存活,與BMSCs組相比,TH-NTN組細胞存活時間長。與PD組及BMSCs組相比,TH-NTN組大鼠右側紋狀體區(qū)TH和NTN蛋白表達顯著增加,有統(tǒng)計學意義。<

17、br>   7.RT-PCR和western blotting結果提示與PD組及BMSCs組相比,TH-NTN組大鼠紋狀體區(qū)TH和NTN mRNA和蛋白含量顯著增加,有統(tǒng)計學意義。
   結論:
   1.密度梯度離心法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs,2~3d后細胞大部分貼壁且開始伸展,繼續(xù)培養(yǎng)后增殖旺盛,其中6~11d增殖趨勢明顯,流式細胞技術及免疫細胞化學技術顯示CD29為陽性,CD34為陰性,鑒定所培養(yǎng)細胞為BMSCs。

18、
   2.成功構建pIRES-TH-NTN質粒并轉染至BMSCs中,獲得穩(wěn)定攜帶pIRES-TH-NTN的TH-NTN-BMSCs,TH-NTN-BMSCs中TH和NTN基因大量轉錄并穩(wěn)定表達TH和NTN蛋白。
   3.單側雙點法成功制備大鼠PD模型,將TH-NTN基因修飾后的BMCSs移植到PD大鼠腦內,與BMSCs組相比,細胞存活時間長,大鼠行為功能明顯改善,紋狀體區(qū)TH和NTN的mRNA和蛋白含量顯著增加,且D

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