CDNF修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療帕金森病的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、大腦多巴胺能神經(jīng)營養(yǎng)因子(CDNF)作為一種新型保守神經(jīng)營養(yǎng)因子，對多巴胺能神經(jīng)元具有特異性的保護(hù)和修復(fù)作用。帕金森病的主要病理變化就是多巴胺能神經(jīng)元的減少。已有研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)作為一種多功能干細(xì)胞，移植入帕金森病模型大鼠之后，能在腦內(nèi)遷移、分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，對帕金森病具有一定程度的治療作用。而作為神經(jīng)營養(yǎng)因子的CDNF是否可以改善細(xì)胞移植治療的效果，是值得研究的課題。本實(shí)驗(yàn)在探討PD的發(fā)生發(fā)展與CDNF表達(dá)量

2、變化的基礎(chǔ)上，嘗試以CDNF基因修飾BMSCs，研究轉(zhuǎn)染CDNF基因的BMSCs(CDNF-BMSCs)移植對PD的治療效果。
　　目的:為了探討大腦多巴胺能神經(jīng)營養(yǎng)因子(CDNF)與帕金森病(PD)發(fā)病之間的關(guān)系，以及以CDNF修飾的BMSCs移植治療PD的效果，對PD模型大鼠腦內(nèi)CDNF的表達(dá)變化及轉(zhuǎn)CDNF基因BMSCs移植治療PD大鼠模型的作用及其機(jī)理進(jìn)行研究。為臨床基因治療帕金森病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:

3、　　(1)使用大鼠腦立體定位儀，單側(cè)紋狀體內(nèi)單點(diǎn)注射6-羥多巴胺制備帕金森病模型，術(shù)后三周腹腔注射阿撲嗎啡誘導(dǎo)大鼠旋轉(zhuǎn)行為，篩選成功模型。免疫組織化學(xué)法、Western blot(WB)及Q-PCR檢測CDNF在帕金森病大鼠模型黑質(zhì)紋狀體中的表達(dá)情況，并以Western blot及免疫組織化學(xué)法檢測相應(yīng)的TH表達(dá)變化。
　　(2)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒載體，采用Lipo2000將重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1(+)-CDNF轉(zhuǎn)染至BM

4、SCs，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測BMSCs體外表達(dá)CDNF情況。使用β-巰基乙醇體外誘導(dǎo)CDNF-BMSCs定向分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，探討基因修飾BMSCs的分化以及分化后表達(dá)CDNF蛋白的潛能。
　　(3)將成功PD模型大鼠分為模型對照組、BMSCs移植組和CDNF-BMSCs移植組三組。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，模型對照組、BMSCs移植組和CDNF-BMSCs移植組的大鼠腦紋狀體內(nèi)分別定位注射PBS(10μl)、BMSCs（10μl，1×104個(gè)

5、/μl細(xì)胞）、CDNF-BMSCs（10μl，1×104個(gè)/μl細(xì)胞）。分別在治療后2周、5周、8周阿撲嗎啡誘導(dǎo)，檢測旋轉(zhuǎn)行為的改變;并于上述時(shí)間點(diǎn)分別取大鼠紋狀體，以免疫組織化學(xué)、WB技術(shù)檢測CDNF及相應(yīng)TH的表達(dá)變化，分析比較治療效果及其作用機(jī)理。
　　結(jié)果:
　　(1)對PD模型大鼠腦組織細(xì)胞學(xué)和相關(guān)蛋白表達(dá)的研究，免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型大鼠腦黑質(zhì)區(qū)CDNF、TH陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少;WB實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠

6、腦的CDNF和TH蛋白表達(dá)量極顯著低于對照組(p＜0.01，n=10); Q-PCR分析表明正常組與模型組間CDNFmRNA表達(dá)水平間不存在顯著差異(p＞0.05，n=5)。本研究顯示PD模型大鼠CDNFmRNA表達(dá)水平與正常大鼠組之間雖無顯著性差異，但多巴胺合成相關(guān)酶及營養(yǎng)因子蛋白表達(dá)卻降低。其原因可能是由于影響CDNF蛋白翻譯或翻譯后修飾的某些因素的水平發(fā)生變化，導(dǎo)致蛋白降低。
　　(2)對重組載體的酶切和測序結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)

7、成功構(gòu)建了CDNF重組載體，且轉(zhuǎn)染CDNF基因的BMSCs成功表達(dá)CDNF蛋白;體外實(shí)驗(yàn)中，CDNF基因修飾的BMSCs，經(jīng)β-巰基乙醇誘導(dǎo)可以分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。說明基因修飾并不影響B(tài)MSCs的分化潛能，且分化后的細(xì)胞仍能表達(dá)CDNF蛋白。
　　(3)細(xì)胞移植治療PD模型大鼠的實(shí)驗(yàn)顯示，移植治療2周后，CDNF-BMSCs組的行為學(xué)改善顯著優(yōu)于BMSCs組(P＜0.05，n=10);移植5周后，CDNF-BMSCs組和BMSCs

8、組動(dòng)物的行為學(xué)改善均極顯著優(yōu)于對照組(P＜0.01，n=10)。WB結(jié)果顯示:移植治療2周后，CDNF-BMSCs組動(dòng)物的CDNF蛋白表達(dá)量極顯著高于BMSCs組(P＜0.01，n=5);CDNF-BMSCs組TH蛋白表達(dá)量顯著高于BMSCs組(P＜0.05，n=5)。免疫組織化學(xué)法檢測TH、CDNF陽性的結(jié)果顯示，CDNF-BMSCs組和BMSCs組動(dòng)物腦紋狀體內(nèi)CDNF、TH陽性細(xì)胞數(shù)均隨時(shí)間逐漸增多(n=5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，BMS

9、Cs和CDNF-BMSCs移植治療PD模型大鼠后，大鼠的行為學(xué)得到了改善，多巴胺神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)與功能部分恢復(fù)，且治療前期使用CDNF-BMSCs的移植治療效果明顯優(yōu)于單獨(dú)移植BMSCs。
　　結(jié)論:本研究運(yùn)用大鼠模型，通過WB、免疫組織化學(xué)、Q-PCR三種檢測方法對帕金森病的發(fā)生發(fā)展與CDNF表達(dá)量的關(guān)系進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)帕金森病的發(fā)病與紋狀體CDNF蛋白表達(dá)量的降低有關(guān)。本研究構(gòu)建了CDNF真核表達(dá)質(zhì)粒載體、成功修飾了BMSCs，在