骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植治療帕金森病的實驗研究.pdf

1、第一章自體骨髓基質(zhì)細(xì)胞腦內(nèi)移植治療帕金森病的實驗研究 目的：將自體骨髓基質(zhì)細(xì)胞(marrow stromal cells，MSCs)體外擴(kuò)增后植入帕金森病(Parkinson disease，PD)大鼠的紋狀體內(nèi)，觀察其在患鼠腦內(nèi)的生存、分化、遷移等變化，以期為研究和治療PD提供新的思路和新的方法。 方法：將6-羥基多巴(6-OHDA)注入大鼠一側(cè)黑質(zhì)致密部(SNc)和中腦腹側(cè)背蓋區(qū)(VTA)內(nèi)，建立PD樣的動物模型。在

2、PD人鼠脛骨處抽取骨髓后，從骨髓中分離出MSCs進(jìn)行培養(yǎng)和擴(kuò)增。在詳細(xì)記錄了每只PD大鼠的旋轉(zhuǎn)次數(shù)后，用5-溴脫氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine，Brdu)標(biāo)記擴(kuò)增的MSCs，以細(xì)胞濃度為l×10′/ml植入同種同體PD大鼠傷側(cè)紋狀體內(nèi)。于術(shù)后7天、14天、21天、30天、60天腹腔注射阿樸嗎啡(Apomorphine，APO)誘導(dǎo)PD大鼠的旋轉(zhuǎn)行為，觀察PD大鼠的行為學(xué)改變；取移植后存活7天、2l天、2個月的PD大鼠的

3、腦組織行Brdu免疫熒光和免疫組織化學(xué)單標(biāo)檢測，觀察移植細(xì)胞的生存和遷移情況；行Brdu/膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)抗體和Brdu/神經(jīng)原纖維(NF)抗體免疫組織化學(xué)雙標(biāo)檢測，觀察 MSCs 是否分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞。實驗設(shè)立生理鹽水替代細(xì)胞對照組和正常大鼠細(xì)胞移植對照組。 結(jié)果：(1)PD 大鼠模型的建立：PD大鼠模型恒定轉(zhuǎn)向健側(cè)，旋轉(zhuǎn)次數(shù)>7r/min；H-E染色和TH免疫組化染色顯示發(fā)現(xiàn)病鼠患側(cè)SNc和VTA多

4、巴胺能神經(jīng)元的數(shù)目明顯減少。(2) MSCs的分離、培養(yǎng)和標(biāo)記：大鼠骨髓的 MSCs體外培養(yǎng)兩周后純化，成梭形，平行排列或漩渦狀生長。經(jīng)細(xì)胞爬片Brdu免疫組化證實85﹪MSCs標(biāo)記上Brdu。(3)MSCs腦內(nèi)移植：腦切片 Brdu 免疫熒光加免疫組化染色結(jié)果顯示移植初期，移植細(xì)胞呈簇狀或串狀沿針道分布，細(xì)胞數(shù)量較多，移植細(xì)胞向周圍組織遷移，以移植區(qū)域為主。隨著時間的推移，移植細(xì)胞逐漸向雙側(cè)紋狀體、大腦皮層、海馬、胼胝體、側(cè)腦室、第三

5、腦室等處遷移。(4)移植7天后，在許多Brdu<,+>細(xì)胞的胞漿中可見到 GFAP 陽性產(chǎn)物，但是未觀察到NF的陽性產(chǎn)物。(5)正常大鼠對照組移植細(xì)胞的存活、遷移、分化情況與 PD 組的結(jié)果相同，兩組無統(tǒng)計學(xué)差異。(6)未移植 PD 模型組、MSCs 移植組、生理鹽水對照組的旋轉(zhuǎn)實驗顯示，移植前后各組動物的旋轉(zhuǎn)行為未見明顯改善。(7)所有動物在移植兩個月內(nèi)未發(fā)現(xiàn)有腫瘤的形成。 結(jié)論：在 PD 腦的微環(huán)境中，MSCs能向腦的許多部

6、位進(jìn)行遷移，并可分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，MSCs用于PD細(xì)胞替代治療有很大的可能性。但 MSCs 在 PD 腦的微環(huán)境中是否可以分化為神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)而發(fā)揮功能改善 PD 的癥狀，尚有待于進(jìn)一步研究。 第二章：大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的實驗研究 目的：觀察大鼠MSCs在維甲酸(Retinoic acid，RA)、RA聯(lián)合膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Glialcell-derived neurotrophic facto

7、L GDNF)、與神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)共培養(yǎng)三種誘導(dǎo)條件下體外分化成神經(jīng)細(xì)胞的能力，為其將來可能的臨床應(yīng)用提供理論和實驗基礎(chǔ)。 方法：在大鼠脛骨處抽取骨髓后，從骨髓中分離出MSCs進(jìn)行培養(yǎng)和擴(kuò)增。取原代第五天的MSCs分別進(jìn)行：A組：0．3ug/ml RA單獨誘導(dǎo)MSCs；B組：0．3u∥ml RA聯(lián)合20n∥ml GDNF誘導(dǎo)MSCs．C組：MSCs與已培養(yǎng)成球的NSCs共培養(yǎng)進(jìn)行誘導(dǎo)，M

8、SCs共培養(yǎng)之前行Brdu標(biāo)記。誘導(dǎo)三大后免疫組織化學(xué)法檢測各組貼壁細(xì)胞GFAP、NF、酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)表面標(biāo)志的表達(dá)，以觀察MSCs的分化情況。 結(jié)果：(1)A組MSCs分裂增殖速度明顯低于B組，在誘導(dǎo)24小時后胞體回縮呈錐形，突起延長且數(shù)量增多，有神經(jīng)元樣形態(tài)，3天后僅有少部分細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物NF。(2)B組MSCs亦出現(xiàn)上述形態(tài)學(xué)上改變，且細(xì)胞間相互連接成網(wǎng)絡(luò)狀，多數(shù)

9、細(xì)胞表達(dá)NF，其中少部分同時表達(dá)多巴胺能神經(jīng)元特異性標(biāo)志物TH。(3)C組：NSCs球很快解離，迅速貼壁，共培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞大量增殖且多呈神經(jīng)元樣，胞體細(xì)長多突起，相互間連接成網(wǎng)。多數(shù)貼壁細(xì)胞分別單獨表達(dá)NF和TH，以及星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物GFAP少數(shù)細(xì)胞可見Brdu/NF，Brdu/GFAP，Brdu/TH雙標(biāo)陽性。 結(jié)論：MSCs在RA、GDNF、NSCs存在的情況下可定向轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元，并有向多巴胺能神經(jīng)元分化的可能。RA