BMSCs移植治療帕金森病細胞學機制的實驗研究.pdf

1、帕金森病(Parkinsons' disease，PD)是常見于中老年人的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。鑒于PD發(fā)病的主要病理機制和干細胞研究的深入，細胞移植治療有望成為治療該病的理想方法之一，但是細胞移植治療的機制尚未明確。本實驗以轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白(GFP)基因大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)作為示蹤細胞，探討外源細胞在治療模型大鼠時，在腦內(nèi)的存活、遷移及分化情況，并結(jié)合大鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)纖維蛋白(GFAP)的表

2、達變化，探究星形膠質(zhì)細胞(AST)在治療PD的作用，為研究臨床PD的細胞移植治療機理提供實驗依據(jù)。
　　實驗一 轉(zhuǎn)GFP基因大鼠BMSCs作為示蹤細胞在移植治療帕金森病研究中的應用
　　采用立體定位法單側(cè)紋狀體內(nèi)單點注射6-羥多巴胺(6-OHDA)制備PD大鼠模型，術(shù)后以經(jīng)典的阿撲嗎啡(APO)誘導大鼠的轉(zhuǎn)圈數(shù)為指標進行行為學檢測，篩選成功PD大鼠模型。取轉(zhuǎn)GFP基因大鼠的BMSCs，將純化的BMSCs定位移植到PD模型大鼠

3、損毀側(cè)紋狀體內(nèi)，移植后2周起用APO誘導大鼠轉(zhuǎn)圈行為，檢測細胞移植對PD模型大鼠的行為改善情況;在熒光顯微鏡下觀察實驗大鼠的腦組織切片，追蹤外源GFP大鼠BMSCs在受體腦內(nèi)的存活、遷移情況;并以免疫組化技術(shù)檢測多巴胺能神經(jīng)細胞的特異性蛋白——酪氨酸羥化酶(TH)的表達，研究分化規(guī)律。
　　成功PD大鼠的轉(zhuǎn)圈數(shù)為10.89±1.08 r/min，轉(zhuǎn)GFP基因大鼠的BMSCs移植腦內(nèi)損毀部位后，從第2周開始，旋轉(zhuǎn)圈數(shù)逐漸減少，到第8

4、周降至5.86±1.15 r/min。細胞移植后，可在紋狀體內(nèi)見到GFP標記的外源細胞，其至少可存活6周;移植后部分細胞向周圍遷移并有一定的走向，可遷移到大鼠腦內(nèi)廣泛區(qū)域;移植的BMSCs形態(tài)上多數(shù)呈現(xiàn)分化形態(tài)，在移植后6周，熒光免疫組化檢測除見到GFP細胞的TH陽性表達，在移植針道周圍還見到大量的內(nèi)源性神經(jīng)細胞出現(xiàn)TH陽性表達，即BMSCs在紋狀體內(nèi)能定向分化為神經(jīng)元樣細胞，并能夠使殘存的多巴胺(DA)能神經(jīng)元功能恢復。
　　研

5、究結(jié)果顯示BMSCs移植技術(shù)，對改善PD模型大鼠的行為有明顯效果，提示可能機制是外源BMSCs在腦內(nèi)經(jīng)誘導分化為多巴胺能神經(jīng)元，部分替代了損毀的多巴胺能神經(jīng)元的功能;移植的外源BMSCs通過產(chǎn)生某些營養(yǎng)因子，有效地恢復模型動物中DA神經(jīng)元的功能或使內(nèi)源性更多的神經(jīng)元樣細胞特異化為合成多巴胺的細胞，從而改善PD模型的癥狀。GFP轉(zhuǎn)基因大鼠的BMSCs由于自發(fā)熒光，移植后方便觀察外源細胞在受體腦內(nèi)的存活、遷移和分化規(guī)律，是細胞移植研究中具有

6、廣泛運用前景的示蹤細胞。
　　實驗二 移植BMSCs對帕金森病模型大鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細胞GFAP表達的影響
　　本研究通過檢測膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的表達，探究腦內(nèi)星形膠質(zhì)細胞(AST)在BMSCs移植治療PD中的功能。實驗分別提取正常大鼠、PD模型大鼠和BMSCs移植治療4周及8周大鼠腦的總RNA和蛋白，再以熒光定量PCR和western blot方法測定腦內(nèi)GFAP的mRNA及蛋白的含量，對比分析模型及治療前后mRN

7、A表達水平的變化與蛋白表達水平變化的聯(lián)系，同時結(jié)合酪氨酸羥化酶(TH)的蛋白表達水平及熒光免疫組化檢測大鼠腦組織內(nèi)TH的表達變化，從而直觀地了解大鼠腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的變化與AST的關(guān)系。
　　結(jié)果顯示，模型大鼠損毀側(cè)腦紋狀體內(nèi)GFAP mRNA的表達水平是正常大鼠的1.33倍，GFAP蛋白表達也高于正常鼠，但是TH蛋白含量明顯減少;BMSCs移植治療后，腦內(nèi)GFAP mRNA的表達逐漸減少，術(shù)后4周的大鼠原損毀側(cè)腦的表達量是對照

8、模型鼠的0.63倍，GFAP蛋白卻增加，TH蛋白表達也增加;術(shù)后8周大鼠原損毀側(cè)腦GFAP mRNA的表達是對照模型鼠的0.30倍，GFAP蛋白亦減少，TH蛋白表達增加，最后均接近于正常大鼠腦內(nèi)蛋白的表達。熒光免疫組化法，可見外源細胞周圍TH含量明顯增多，代替多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)元樣細胞也較模型大鼠增多。
　　BMSCs移植治療PD大鼠模型的過程中，正常動物腦內(nèi)GFAP免疫組化表達陰性，但在制備PD模型的過程中，星形膠質(zhì)細胞活化，

9、并出現(xiàn)GFAP的增強表達，成為反應性星形膠質(zhì)細胞，而損傷修復后GFAP的表達又呈陰性。GFAP是星形膠質(zhì)細胞活化的獨有標志，因此，研究星形膠質(zhì)細胞在治療帕金森大鼠模型研究中的變化對探究帕金森治療機制有重要意義。作為支撐性細胞，能準確引導神經(jīng)元遷移到腦內(nèi)損傷部位，并且分泌出大量的營養(yǎng)因子，促進DA神經(jīng)元的生成而修復黑質(zhì)-紋狀體DA神經(jīng)通路，其中最為重要的營養(yǎng)因子GFAP，對脊椎動物有強烈的保護作用，并且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中行使重要功