脂肪源性神經(jīng)干細胞移植治療帕金森病模型鼠.pdf

1、目的：探討脂肪干細胞（adipose-derived strom cell，ADSCs）誘導分化為神經(jīng)干細胞（neuralstemcells，NSCs）移植治療帕金森?。≒D）模型鼠的療效及可能作用機制。
　　 方法：⑴利用膠原酶消化法體外分離培養(yǎng)ADSCs，流式細胞儀檢測第三代ADSCs的表面表型CD44、CD45、CD29的表達。利用堿性成纖維細胞生長因子（bFGF），表皮生長因子（EGF）及B27建立神經(jīng)干細胞培養(yǎng)體系，誘

2、導第三代ADSCs分化為NSCs和神經(jīng)細胞。觀察細胞形態(tài)學變化，免疫熒光染色檢測誘導的NSCs巢蛋白（nestin），神經(jīng)元（NF-200）及神經(jīng)膠質(zhì)細胞（GFAP）的表達；⑵采用6-羥基多巴胺（6-OHDA）單側(cè)兩點毀損法制作PD大鼠模型，阿撲嗎啡（APO）誘導旋轉(zhuǎn)實驗觀察行為學變化，免疫組化法觀察模型鼠腦內(nèi)紋狀體區(qū)TH（酪氨酸羥化酶）陽性細胞數(shù)量變化情況；⑶成功的PD大鼠模型隨機分為兩組，誘導的NSCs移植組（22只），生理鹽水組（

3、22只），正常對照組（16只）：細胞移植前48h，加入5-溴-2-脫氧嘧啶（Brdu）進行標記。各組分別在紋狀體區(qū)注入Brdu標記ADSCs源性的NSCs（1.2×106個/只）和生理鹽水（12μl）。在干預前、干預后2周、4周、8周行APO誘導的大鼠旋轉(zhuǎn)實驗；腦冰凍切片免疫熒光雙標鑒定細胞成活分化情況；8周時，免疫組化染色觀察TH陽性細胞數(shù)量變化，高效液相色譜法檢測腦內(nèi)DA含量，RT-PCR技術(shù)檢測移植后大鼠腦內(nèi)THmRNA的表達。<

4、br>　　 結(jié)果：⑴細胞檢測：①ADSCs的檢測：ADSCs成纖維狀單層生長；其表面表型CD29（99.00±0.12）%，CD44（95.62±0.68）%，CD45（0.13±0.12）%。②NSCs和神經(jīng)細胞檢測：誘導后細胞呈球形并可以增殖，免疫熒光檢測可見細胞球nestin陽性表達，加入血清后分化為神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞（NF-200和GFAP陽性表達）。⑵模型的檢測：①100只大鼠中經(jīng)APO誘導后44只（占44%）持續(xù)轉(zhuǎn)向健

5、側(cè)（旋轉(zhuǎn)圈數(shù)＞7r/min），帕金森病大鼠模型復制成功。注射側(cè)紋狀體區(qū)TH免疫陽性細胞明顯減少；⑶干預后檢測：①旋轉(zhuǎn)實驗：細胞移植治療2周各組無差異，4周、8周后，NSCs組好于生理鹽水組（P＜0.05）。②免疫熒光雙標檢測：8周可見Brdu/nestin、Brdu/NF-200、Brdu/GFAP陽性細胞，未見到Brdu/TH陽性細胞。③RT-PCR顯示：NSCs組THmRNA較生理鹽水組表達增高。④高效液相色譜法顯示腦內(nèi)DA含量：N