神經(jīng)干細(xì)胞移植于帕金森病模型大鼠紋狀體后存活和分化的研究.pdf

1、背景和目的：帕金森病(Parkinson disease，PD)是一種常發(fā)生于中老年人的神經(jīng)退行性疾病，其主要病理變化為黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元的變性及其導(dǎo)致的紋狀體區(qū)多巴胺水平的降低。目前，細(xì)胞移植是治療該病的一種理想的方法。而神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)因其具有自我更新能力及多向分化潛能已成為治療神經(jīng)退行性疾病的理想細(xì)胞供體。雖然以NSCs移植治療PD的實(shí)驗(yàn)研究已取得較好的療效，但由于缺乏可靠的示蹤技術(shù)，

2、難以對(duì)移植細(xì)胞進(jìn)行追蹤觀察和檢測(cè)，對(duì)臨床療效的確定缺乏有力的證據(jù)。為了探討NSCs移植治療PD的細(xì)胞學(xué)機(jī)制，本研究分別從孕14天的SD胎鼠中腦和新生的轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白(Green fluorescentprotein,GFP)基因小鼠的海馬分離NSCs，體外培養(yǎng)擴(kuò)增后移植到PD模型大鼠的紋狀體內(nèi)，觀察大鼠的行為學(xué)變化以及移植細(xì)胞在腦內(nèi)的存活、分化等情況，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 研究?jī)?nèi)容與方法：(1)以機(jī)械吹打法分離孕14天

3、胎鼠中腦細(xì)胞，接種于含bFGF、EGF和B27的DMEM/F12無血清完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過巢蛋白(Nestin)的特異性顯色對(duì)培養(yǎng)的NSCs進(jìn)行鑒定；以10％DMSO+10％FBS+15％B27+DMEM/F12作為冷凍保護(hù)液凍存細(xì)胞，解凍后檢測(cè)細(xì)胞活力，并對(duì)NSCs進(jìn)行生物學(xué)鑒定；采用含胎牛血清的培養(yǎng)基對(duì)NSCs誘導(dǎo)分化后，分別通過檢測(cè)特異性的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、特異性的烯醇化酶(NSE)來鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，確證N

4、SCs分化的潛力。(2)將培養(yǎng)擴(kuò)增、經(jīng)5-溴脫氧尿嘧啶(BrdU)標(biāo)記后的NSCs定向移植到PD模型大鼠的紋狀體內(nèi)，以阿樸嗎啡(apomorphine，APO)誘導(dǎo)觀察大鼠旋轉(zhuǎn)行為的變化；并于不同時(shí)間對(duì)腦紋狀體取材、冰凍切片，免疫組化觀察移植細(xì)胞在腦內(nèi)的存活與分化情況。(3)從新生GFP小鼠海馬分離NSCs，采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)NSCs特征性標(biāo)志nestin表達(dá)和分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞能力。將培養(yǎng)擴(kuò)增后表達(dá)GFP的

5、NSCs移植到PD模型大鼠的紋狀體內(nèi)，檢測(cè)大鼠的行為學(xué)變化；熒光顯微鏡下檢測(cè)熒光細(xì)胞的分布和遷移，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)移植細(xì)胞在紋狀體微環(huán)境內(nèi)向多巴胺能神經(jīng)元分化的狀況，分析NSCs移植治療PD的機(jī)理，為NSCs紋狀體內(nèi)移植治療PD的可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 結(jié)果：(1)機(jī)械吹打胎鼠中腦腹側(cè)組織分離NSCs，其平均存活率為90％。細(xì)胞培養(yǎng)6天后傳代，傳代后的NSCs增殖生長(zhǎng)迅速，本實(shí)驗(yàn)已傳到6代；用同樣方法從新生GFP小鼠海馬

6、分離的NSCs生長(zhǎng)良好，連續(xù)傳5代后，單個(gè)細(xì)胞和神經(jīng)球均正常表達(dá)GFP;兩種細(xì)胞經(jīng)Nestin鑒定呈陽(yáng)性，證明增殖的細(xì)胞為NSCs。(2)分離的兩種細(xì)胞在分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)后，免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定顯示可分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，證明分離的NSCs具有多向分化潛能。(3)P0-P3代的NSCs在液氮凍存，解凍后細(xì)胞的存活率在54％～66％之間，復(fù)蘇后仍保持原有的NSCs特性。(4)與對(duì)照組相比，細(xì)胞移植組都可使PD鼠的旋轉(zhuǎn)行為得到明顯改善，治

7、療效果在4-6周達(dá)到最佳。(5)移植細(xì)胞在宿主體內(nèi)的存活、分化和遷移情況。①存活：細(xì)胞移植后，可在紋狀體內(nèi)見到BrdU標(biāo)記的細(xì)胞和GFP細(xì)胞，其至少可存活8w。②分化：在移植后4w，免疫組化檢測(cè)可見針道周圍有TH陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)，說明NSCs在紋狀體內(nèi)能定向分化為多巴胺能神經(jīng)元。③遷移：移植后的兩種細(xì)胞并不局限于注射位點(diǎn)，部分細(xì)胞向周圍遷移并有一定的走向，但來源于新生的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的NSCs可以更好的觀察移植細(xì)胞的遷移情況。(6)從GF

8、P轉(zhuǎn)基因小鼠中分離的熒光細(xì)胞移植后，可以動(dòng)態(tài)的觀察其在宿主體內(nèi)的存活、分化和遷移情況。在移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面，其可以作為一種較高應(yīng)用價(jià)值的示蹤種子細(xì)胞。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)以機(jī)械分離法獲得的NSCs在無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能夠不斷增殖且保持NSCs的生物學(xué)特性。將其定位移植到PD模型大鼠紋狀體內(nèi)，可明顯改善后者的行為。移植細(xì)胞能在PD模型大鼠紋狀體的存活、遷移，并分化為多巴胺神經(jīng)元以替代損傷的該種神經(jīng)元而達(dá)到治療PD的目的。本