大鼠紋狀體內注射LV-Shh促進帕金森病模型大鼠神經再生.pdf

1、背景:
　　 帕金森病(Parkinsondisease，PD)是由于黑質多巴胺能神經元(dopaminergicneurons，DANs)進行性丟失，導致紋狀體尾狀核-殼核多巴胺(dopamine，DA)支配喪失，引起靜止性震顫、肌強直和運動障礙等癥候群，其發(fā)病率逐年增高，目前臨床尚無特效療法。主要的藥物治療大多是暫時緩解癥狀。左旋多巴及多巴胺能受體激動劑只能緩解疾病早期的運動障礙，長期服用可能會造成許多副作用，如左旋多巴誘導

2、的運動障礙，“開關”現(xiàn)象，幻覺，嗜睡等。此外，非藥物療法如深部腦刺激雖然可以改善患者的運動障礙和生活質量，但具體的機制仍然不明確，且可能造成新的損傷。
　　 目前認為，細胞替代療法(cellreplacementtherapy,CRT)可能是治療帕金森病的最佳途徑之一。它與以往傳統(tǒng)的以緩解癥狀為主的治療方法不同，細胞替代療法是建立在更全面認識帕金森病的發(fā)病機制的基礎上，以替代和修復變性和壞死的多巴胺能神經元為目的的療法。而傳統(tǒng)的

3、外源性細胞替代療法是采用胚胎干細胞(embryonicstemcells，ESCs)，神經干細胞(neuralstemcells，NSCs)或者骨髓間充質干細胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells，BMSCs)進行移植，但研究表明這種移植方式尚面臨來源受限、移植后功能差、低存活率、安全性不確定、臨床可操作性差以及倫理學問題等，且移植后可致運動障礙，出現(xiàn)步態(tài)失調、跌倒、強直、甚至癡呆等非多巴胺能病

4、理特征，植入的DANs存活率低，其內甚至出現(xiàn)Lewy小體。
　　 有鑒于此，本課題提出內源性CRT設想:在外源性因素的刺激下，宿主內源性神經干細胞或神經前體細胞增殖、遷移至損傷部位并原位分化為局部細胞，最終在結構和功能上恢復受損組織。在成體中樞神經系統(tǒng)(centralnervoussystem，CNS)存在有兩個干細胞壁龕，分別是側腦室腦室下區(qū)(subventricularzone，SVZ)和海馬齒狀回(dentategyrus

5、，DG)。其內的神經干細胞終生持續(xù)處于增殖狀態(tài)和神經元替代現(xiàn)象，并沿一定路徑遷移。而且SVZ是成體神經系統(tǒng)中最大的干細胞庫。因此，通過外源性的刺激營造SVZ內的NSCs(SVZ-NSCs)增殖、遷移至黑質-紋狀體系統(tǒng)，分化為多巴胺能神經元并原位與周圍的神經元整合而產生有功能的內環(huán)境，從而達到治療的效果，這可能是治療帕金森病的新思路。我們在文獻調研中發(fā)現(xiàn)，Sonichedgehog(SHH)為影響神經系統(tǒng)發(fā)生、發(fā)育乃至中腦多巴胺能神經元形

6、成的眾多相關因子中最為關鍵的核心因子。
　　 SHH為Hedgehog家族成員之一，另外兩個家族成員分別是deserthedgehog(DHH)和Indianhedgehog(IHH)。SHH是涉及在胚胎發(fā)育中重要的分泌性多肽之一。它最初是由脊索和底板所分泌，在胚胎發(fā)育過程中調節(jié)多種組織器官的形成和發(fā)生。它是CNS模式、增殖和細胞命運調節(jié)的關鍵性信號分子。SHH信號為出生后和成體腦內NSCs和神經發(fā)生的關鍵性機制，并維持終生。此

7、外，文獻也報道SHH具有促進多種神經元增殖、分化、促進軸突生長和軸突導向以及神經元的營養(yǎng)和保護等作用。其前體蛋白合成后自我催化裂解為分子量為19kD的N端片段(N-terminalproductofShh，SHH-N)，而SHH的功能區(qū)主要集中在N端，而非C端，且C端易造成整個蛋白肽鏈的斷裂。因此，本實驗的研究重點集中在SHH-N。
　　 目的:
　　 本課題擬在克隆出目的基因Shh-N并將其構建至慢病毒載體的基礎上，以

8、帕金森病大鼠為模型(立體定位注射6-羥基多巴(6-OHDA)損毀大鼠紋狀體），將包裝成功的病毒顆粒立體定位注射于大鼠紋狀體的損毀區(qū)域，檢測Shh在體過表達的情況，鑒定損毀區(qū)域神經修復（殘存或新生神經元/神經膠質細胞，黑質-紋狀體通路）情況，結合行為學觀察，試圖證實內源性治療PD的可行性，并探討其內源性機制。
　　 方法:
　　 1.Shh-N基因的克隆和載體構建:從9天胎鼠的脊索組織中提取的總RNA，通過巢式逆轉錄聚合酶

9、鏈式反應(nestedRT-PCR)克隆出目的基因Shh-N并純化，將其連接至慢病毒載體PCDH-MSC-T2A-copGFP-MSCV上構建重組體PCDH-Shh-T2A-copGFP-MSCV(LV-Shh)。通過穩(wěn)定轉染法包裝生產慢病毒LV-Shh，實時熒光定量PCR(realtime-PCR)測定病毒滴度。
　　 2.帕金森病大鼠模型制作及實驗分組:采用6-OHDA兩點注射損毀紋狀體的方法制作帕金森病的大鼠模型，根據(jù)不同

10、的處理分為以下4組:
　　 1)實驗組(LV-Shh):于24小時后在大鼠紋狀體的同一坐標點注射慢病毒LV-Shh
　　 2)空載體組(LV):于24小時后在大鼠紋狀體的同一坐標點注射慢病毒LV
　　 3)假手術組（Sham）:假手術處理
　　 4)空白對照組(Blank):不做任何處理
　　 每組依次分為三個時間點:2周(Ⅰ)，4周(Ⅱ)，8周(Ⅲ)。分別采用Westernblot和RT-PCR

11、的方法檢測Shh-N的表達情況。
　　 3.指標檢測:在各個時間點處死前7天，各組大鼠均進行雙側紋狀體內注射紅色熒光金(Fluro-ruby,FR)。在三個時間點中的各組分別到達2周，4周，8周后，每組均采用頸背部正中皮下注射阿樸嗎啡的方法進行旋轉行為的檢測。行為學檢測結束后進行功能性檢測，采用免疫熒光，Westernblot和紅色熒光金示蹤相結合的方法觀察紋狀體內注射LV-Shh對殘存的DNAs和新生的神經元或神經膠質細胞以及

12、內源性NSCs的影響。
　　 4.統(tǒng)計學分析:采用單因素的方差分析方法分析SHH-N在蛋白水平上各組過表達情況。采用析因分析方法分析紋狀體內注射LV-Shh對PD大鼠旋轉行為的恢復情況，F(xiàn)R示蹤的黑質-紋狀體系統(tǒng)神經軸突的改善情況以及紋狀體TH陽性的突觸和黑質TH陽性的神經元存活情況。同時采用單因素的方差分析方法分析8周各組蛋白表達情況。
　　 結果:
　　 1.成功構建慢病毒的重組體PCDH-Shh-T2A-c

13、opGFP-MSCV;生產的慢病毒濃縮后測得的病毒滴度為:2×107IU/ml。
　　 2.Shh/SHH過表達情況:nestedRT-PCR結果顯示Shh在RNA水平上各時間點（2周、4周、8周）于各組均有表達;Westernblot結果顯示在蛋白水平上于8周時的表達顯著高于2周、4周、空載體組、假手術組以及空白對照組(P＜0.01)。
　　 3.紋狀體內注射LV-Shh-N可以改善PD模型大鼠的行為:阿樸嗎啡誘導旋轉

14、行為實驗中，與2周和4周進行對比，8周的LV-Shh組的旋轉行為顯著改善(P＜0.01)。
　　 4.紋狀體內注射LV-Shh-N可以恢復部分DNAs的功能:與2周和4周對比，8周的LV-Shh組紋狀體內TH陽性的突觸和黑質致密部TH陽性的神經元顯著高于其他各組(P＜0.05)。
　　 5.紋狀體內注射LV-Shh-N可以改善黑質紋狀體投射系統(tǒng)的通路:紅色熒光金(fluoro-ruby,FR)示蹤神經軸突的實驗中，與2周

15、和4周進行對比，8周的LV-Shh組紋狀體和黑質致密部FR標記的軸突的分布范圍和平均光密度較其他各組均有顯著提高(P＜0.05)。
　　 6.紋狀體內注射LV-Shh-N可以誘導產生新生的NSCs和神經膠質細胞:與2周和4周進行對比，8周的LV-Shh組紋狀體的損毀側出現(xiàn)GFAP抗原陽性，其他組均未見;且Westernblot結果顯示GFAP蛋白表達顯著高于8周時間點其他各組(P＜0.001);而在8周的LV組損毀側出現(xiàn)Nest