帕金森病模型大鼠神經干細胞移植基礎研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種發(fā)生于中老年期的，緩慢進展的神經系統(tǒng)退行性疾病，主要病理改變?yōu)橹心X黑質致密部(substantia nigrapars compacta，SNc)多巴胺(dopamine，DA)能神經元變性死亡，導致紋狀體來自黑質的DA能神經末梢減少，從而引起震顫、肌肉僵直、運動遲緩與體位不穩(wěn)等一系列綜合病癥(Lotharius and Brundin，2002)。PD是繼阿爾茨海默病(Al

2、zheimer's disease，AD)之后第二大常見的神經系統(tǒng)退行性疾病，隨著人口平均壽命延長和老齡化出現，PD的發(fā)病率呈現明顯的上升勢頭。藥物治療以及腦深部電極(deep-brain stimulation，DBS)埋藏治療可在一定程度上緩解患者的癥狀，但都存在一些副作用，而且不能從根本上抑制腦內DA能神經元的持續(xù)性死亡。近年來神經干細胞(neural stem cells，NSCs)的研究為細胞替代療法治療PD提供了潛在的應用前

3、景，通過移植神經干細胞不但可以來替代部分丟失的的DA能神經元的功能，而且可以通過移植具有分泌神經營養(yǎng)因子特性的細胞抑制DA能神經元的丟失，長期有效地改善患者的癥狀。
　　 在本研究的第一部分，我們利用本實驗室建立的胚胎大鼠NSCs的取材和培養(yǎng)方法，分離E14 SD大鼠胚胎前腦室下帶區(qū)(subventricularzone，SVZ)神經組織，在含有多種神經營養(yǎng)因子的無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，經傳代后培養(yǎng)出大量NSCs標記分子--神經

4、巢蛋白(neuro epithelial stem cell protein，Nestin)陽性克隆球團。經免疫組織化學方法檢測，這些陽性細胞克隆球團經誘導分化后可以分化為神經元、星型膠質細胞和少突膠質細胞，此結果說明本實驗取自E14 SD大鼠SVZ區(qū)域的細胞具有自我增殖和多潛能分化特性。為長期跟蹤移植細胞在體內存活、生長、遷移及分化的過程，我們運用用攜帶有增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent pro

5、tein，EGFP)基因的重組腺相關病毒(rAAV2-EGFP)在體外培養(yǎng)條件下感染NSCs，通過病毒在細胞內表達EGFP使細胞帶有綠色熒光標記。實驗中發(fā)現，被AAV2-EGFP感染后的NSCs仍具有持續(xù)的分裂增殖能力。EGFP標記的NSCs體外誘導分化后，整個細胞從胞體到突起末梢都帶有綠色熒光標記，較好顯示出了細胞的完整形態(tài)，經測定，體外EGFP標記率為65％。在第一部分研究，我們成功建立了NSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定和EGFP標記示蹤

6、的方法。
　　 PD在動物中沒有自發(fā)傾向，進行PD實驗研究需要建立適當的動物模型(陳生弟，陳先文，2003)。建立穩(wěn)定的能模擬人類PD病理學和行為學改變的動物模型，對PD的發(fā)病機制和治療等方面的研究具有重要的意義。PD大鼠模型由于可直接觀察行為學改變、經濟和易于操作等原因，成為目前應用最廣的研究模型。現在PD模型的制作方法較為成熟，常用的是6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)損毀模型。在第二部分實驗

7、中，我們采用了單點內側前腦束(medialforebrain bundle，MFB)注射6-OHDA方法制備一側黑質損毀PD動物模型。共制備模型105只SD大鼠(Sprague Dawley，SD)。建模4周后經阿樸嗎啡(apomorphine，APO)誘發(fā)旋轉，旋轉7 r/min以上者為成功模型，共有57只，行為學檢測造模成功率為54％。模型動物造模成功后分別在30，60和120天后再次進行行為學檢測以跟蹤動物的自我恢復可能性，統(tǒng)計結

8、果顯示與造模成功后的初次檢測結果無顯著性差異(P>0.05)，表明PD模型穩(wěn)定，沒有自我修復現象。對PD模型組動物中腦黑質酪氨酸羥化酶(tyrosion hydrozylase，TH)免疫組織化學檢測發(fā)現，成功PD大鼠中腦黑質正常側TH反應陽性神經元數量較多，胞體較大，突起明顯；而6-OHDA損毀側TH陽性神經元數量則明顯減少，細胞丟失超過90％以上。120天后PD模型動物損傷側神經元數量減少仍然在90％以上，從組織學上證明模型的穩(wěn)定。

9、我們對成功的PD模型大鼠和正常大鼠分別在黑質或紋狀體移植rAAV2-EGFP標記的NSCs，移植后30、60和120天進行行為學檢測。結果表明，NSCs移植到PD大鼠黑質或者紋狀體，隨著移植細胞在宿主腦內存活時間的延長，動物的行為學癥狀得到顯著改善(P<0.05，P<0.01)。
　　 在NSCs移植療法中，NSCs作為一種外源性物質能否在損傷的黑質區(qū)域存活或者遷移，能否向黑質特定DA能神經元分化是細胞移植治療PD療效的關鍵。在

10、第三部分實驗中我們研究了移植細胞的行為變化。在細胞移植后30、60和120天不同時期取腦進行連續(xù)切片，在移植后不同時間的腦片上我們均發(fā)現了大量EGFP標記的細胞，說明EGFP作為示蹤記在細胞移植后仍然長期穩(wěn)定表達，外源性的NSCs可以通過異體移植在宿主內長期存活。對各時間段有移植細胞標記的腦片進行免疫組化檢測，結果顯示移植的細胞可以分化為多種神經元，星形膠質細胞和少突膠質細胞。通過EGFP的示蹤顯示，移植細胞具有遷移現象并存在一定規(guī)律。

11、移植到黑質的細胞隨著時間的延長，在黑質區(qū)遷移的距離也越遠，但總體上移植細胞是在受損的黑質區(qū)域內遷移，只有少量的細胞遷移到黑質區(qū)域以外。移植到紋狀體的細胞呈條索狀排列從移植位點向腹后內側黑質部位進行較為廣泛的長距離遷移，遷移具有明顯的方向性并在黑質致密部可見散在移植細胞。實驗結果提示移植的NSCs可以在體內存活并有遷移和分化能力，CNS損傷區(qū)微環(huán)境對移植細胞的遷移和分化具有一定誘導作用。
　　 綜上所述，我們得出以下結論：

12、　　 1,從E14天胚胎大鼠SVZ分離出來的神經細胞群，能不斷的更新和增殖，具有良好的可傳代性，體外培養(yǎng)可以誘導分化為神經元，星形膠質細胞和少突膠質細胞等多種類型，具有自我增殖和多潛能分化的干細胞特性。利用rAAV2-EGFP感染NSCs，可以使NSCs帶有穩(wěn)定綠色熒光標記，標記后NSCs仍具有增殖和分化特性。成功建立了胚胎大鼠NSCs的培養(yǎng)、鑒定和EGFP示蹤標記方法。
　　 2,單點MFB注射6-OHDA制備一側黑質損毀P

13、D動物模型，應用免疫組化和行為學檢測證明模型制作成功、可靠并可以長期保持穩(wěn)定。用體外培養(yǎng)的rAAV2-EGFP標記的NSCs移植PD模型大鼠紋狀體或者黑質，隨著移植細胞在宿主腦內存活時間的延長，可以明顯改善PD動物行為學癥狀。
　　 3，跟蹤NSCs移植后不同時間段移植細胞的分化和遷移特性。移植細胞在宿主腦內分化為多種神經元，星形膠質細胞和少突膠質細胞。移植細胞具有遷移現象并存在一定規(guī)律。移植到黑質的細胞總體上在受損的黑質區(qū)域內