中樞離斷兔股神經干細胞源性神經元細胞移植.pdf

1、研究目的：周圍神經缺損的修復，是世界性的難題。主要是神經生長速度慢和效應器、感受器萎縮快的矛盾。如何提高神經再生的速度和質量，尋找新的修復方法是周圍神經損傷迫切需要解決的瓶頸問題。目前周圍神經缺損的治療策略，是依據周圍神經損傷再生的理論，通過提供一個神經纖維再生通道、營造有利于神經纖維再生微環(huán)境等，促進神經再生的，沒能解決神經快速到達效應器、感受器的問題。鑒于此，我們提出了“橋接神經元修復周圍神經缺損”的設想，即通過神經元接力的方法，加

2、快神經到達效應器、感受器的時間，減少效應器、感受器病變程度，提高神經損傷修復的效果。為驗證此設想，我們實驗室將種植非神經干細胞性成體干細胞源性神經元細胞構建的組織工程化神經移植于鼠、犬外周神經損傷缺損模型中，發(fā)現，支架材料上的非神經干細胞性成體干細胞源神經元細胞，可以在外周神經微環(huán)境中存活、增殖、形成突觸聯(lián)系，促進了神經功能的修復。但是，種植在外周神經中的成體干細胞源神經元細胞，是促進了新生軸突的生長，還是建立了與中樞以及效應器之間的連

3、接，缺乏有力的證據。為觀測非神經干細胞性成體干細胞源性神經元細胞，在外周神經微環(huán)境中能否維持神經元細胞的生理學功能，以及能否與效應器（肌肉）形成連接，本課題擬將這種神經元細胞種植于已與中樞離斷的家兔股神經遠端神經干內，通過研究種植細胞的演變及股四頭肌的狀況來評價“橋接神經元修復周圍神經缺損”設想的可行性。
　　 研究方法：本實驗采用了骨髓神經組織定向干細胞為種子細胞。從兔髂后上嵴獲取骨髓細胞后，分離、擴增、無血清培養(yǎng)，并使用化學

4、誘導的方法向神經元方向進行誘導分化。誘導48小時后，神經元及膠質細胞特異性表面標志物Nestin、β-Ⅲ tubulin、synapsin Ⅰ、S-100、GFAP的免疫細胞熒光化學染色鑒定。實驗分3組。實驗組，家兔右下肢在股神經皮支與肌支的交匯處上方0.5cm 處剪斷神經。遠側斷端，神經離斷處去除1mm 神經軸索，結扎后，縫扎于腹股溝韌帶上；去神經軸索處，種植1×104的誘導性神經元細胞；對照組同部位注射等量細胞培養(yǎng)液；假手術組，兔左

5、下肢，手術暴露股神經。觀察兔實驗后肢運動情況；術后5、7、 9、11、12、14、19、23、24、26周用電刺激外周神經干的方法檢查肌肉的興奮性以及神經傳導（復合肌肉動作電位，CAMP）；細胞移植后26周處死動物，取材，光鏡、透射電鏡觀測形態(tài)結構，免疫組織化學檢測NF-M、S-100、NeuN、ChAT，甲苯胺藍染色觀察髓鞘形成。
　　 實驗結果：骨髓神經組織定向干細胞經無血清培養(yǎng)向神經元方向誘導后，細胞成團生長，部分細胞伸出

6、軸突樣突起，免疫細胞熒光化學顯示神經元特異性的表面抗原Nestin、β-Ⅲ tubulin、synapsin Ⅰ表達陽性，膠質細胞特異性的表面抗原S-100、GFAP 則基本不表達。細胞移植后第5周微弱的復合肌肉動作電位（CAMP）出現，CAMP的波幅隨手術恢復時間的延長而逐步增大，兩者具有線性相關關系。術后26周，實驗組，神經干內細胞，神經元特異性標志物NF-M、NeuN 染色陽性，少數細胞膽堿能運動神經元標志物ChAT 染色為陽性，

7、神經膠質細胞標志物S-100染色陽性表達。實驗組神經干內形成了有髓神經纖維，但是密度明顯低于假手術組；實驗組神經元軸突結構被雪旺細胞形成的髓鞘所包裹，髓鞘周圍基板完整，在軸突結構內觀察到了線粒體樣細胞器，但髓鞘的厚度差別很大。
　　 結論：
　　 1.骨髓神經組織定向干細胞可以作為移植神經元細胞的來源。
　　 2.中樞離斷周圍神經動物模型，由于排除了中樞神經和新生軸突的影響，可以作為評價周圍神經神經元細胞移植效果