菲立磁標(biāo)記骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植治療帕金森病的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、帕金森?。≒arkinson's disease PD）是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其病理改變的最大特點(diǎn)是病變只侵犯中腦的多巴胺（DA）能神經(jīng)元，導(dǎo)致紋狀體內(nèi)DA的減少從而引起運(yùn)動(dòng)遲緩，靜止性震顫，肌強(qiáng)直等錐體外系癥狀。目前藥物治療和手術(shù)治療可使患者的癥狀在一定時(shí)間內(nèi)獲得不同程度的好轉(zhuǎn)，但無法阻止本病的自然進(jìn)展。隨著神經(jīng)生物學(xué)，分子生物學(xué)及移植免疫學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，腦移植和基因治療成為理論上治療帕金森病最好的方法，其中通過移植干

2、細(xì)胞替代受損的細(xì)胞，重建神經(jīng)功能區(qū)和傳導(dǎo)通路是近年研究的重點(diǎn)。 干細(xì)胞根據(jù)其來源可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。骨髓基質(zhì)細(xì)胞（Bone Marrow Stromal Cells，BMSCs）是一種位于成年動(dòng)物骨髓的成體干細(xì)胞。在體外，BMSCs在一定的環(huán)境和條件下可分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，表達(dá)多種神經(jīng)元特異性標(biāo)志物。在體內(nèi)，BMSCs可以穿越血腦屏障，與局部的組織整合，遷移到腦組織中的不同位置分化為不同類型的神經(jīng)細(xì)胞。除此之外，BMS

3、Cs還具有自我更新和高度增殖等干細(xì)胞的特點(diǎn)。而且具有材料容易獲得，分離培養(yǎng)較為容易，為同種同體細(xì)胞來源，無抗原性等優(yōu)點(diǎn)，是神經(jīng)系統(tǒng)疾病細(xì)胞替代治療理想的靶細(xì)胞。 本研究應(yīng)用骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)、分離和擴(kuò)增，用超順磁性氧化鐵微粒（Superparamagnetic iron oxide，SPIO）（商品名：菲立磁Feridex）標(biāo)記后，定向注入大鼠紋狀體、頸動(dòng)脈、尾靜脈移植治療帕金森病大鼠模型，應(yīng)用磁共振對移植的細(xì)胞進(jìn)行活體示蹤，

4、結(jié)合病理學(xué)，觀察骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)遷移、腦內(nèi)存活和神經(jīng)分化以及帕金森病大鼠癥狀的改善情況。 第一部分:大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化的研究 目的：探索大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）的體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化方法。方法：體外分離SD大鼠骨髓，貼壁法擴(kuò)增培養(yǎng)大鼠BMSCs，相差顯微鏡觀察其生長特性及形態(tài)變化，傳代至第4代后用神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)分化，在誘導(dǎo)后第3天和第7天分別行

5、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、巢蛋白（nestin）、酪氨酸羥化酶（TH）、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行鑒定。結(jié)果：培養(yǎng)的BMSCs在第4代純度在95%以上，大鼠BMSCs經(jīng)表皮生長因子（EGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、全反式維甲酸（TRA）等誘導(dǎo)后能表達(dá)nestin、NSE、GFAP等特異性標(biāo)記物，未出現(xiàn)TH染色陽性細(xì)胞。結(jié)論：BMSCs在體外擴(kuò)增迅速，易純化，聯(lián)合應(yīng)用

6、細(xì)胞因子可誘導(dǎo)BMSCs形成神經(jīng)干細(xì)胞，并向神經(jīng)元分化。 第二部分:應(yīng)用6—羥基多巴胺建立帕金森病大鼠模型研究 目的：建立簡單、易行、成功率高的偏側(cè)帕金森病大鼠模型。方法：SD大鼠80只，注射同等劑量的6．羥基多巴胺（6—OHDA）于內(nèi)側(cè)前腦束不同部位。位點(diǎn)1：前囟后1．8mm、右側(cè)2mm、硬膜下8．5mm；位點(diǎn)2：前囟后1．8mm、右側(cè)2mm、硬膜下7．5mm，制作黑質(zhì)完全損傷型PD大鼠模型，運(yùn)用阿樸嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)及

7、免疫組化檢驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠癯晒?。磁共振活體檢測PD大鼠黑質(zhì)、紋狀體的毀損情況。結(jié)果：注射6—OHDA后第4周內(nèi)有54只大鼠誘發(fā)明顯的旋轉(zhuǎn)行為，且旋轉(zhuǎn)次數(shù)>7轉(zhuǎn)/min，模型成功率為75%。MRI顯示模型大鼠第1周后毀損側(cè)黑質(zhì)較對側(cè)出現(xiàn)了明顯的MRI低信號區(qū)，且隨著時(shí)間的延長低信號區(qū)逐漸減小，至第3周已基本消失。結(jié)論：應(yīng)用6—OHDA小劑量兩點(diǎn)毀損內(nèi)側(cè)前腦束制備的偏側(cè)帕金森病大鼠模型具有較高的成功率，是帕金森病研究較為理想的模型。MRI掃描可以

8、活體連續(xù)觀察帕金森病大鼠模型的毀損情況，是客觀評價(jià)和檢測帕金森病大鼠模型的一種有效工具。 第三部分:菲立磁標(biāo)記骨髓基質(zhì)細(xì)胞治療帕金森病大鼠及磁共振示蹤 目的：探討應(yīng)用骨髓基質(zhì)細(xì)胞治療帕金森病大鼠的機(jī)制及療效，以及菲立磁（Feridex）標(biāo)記的BMSCs移植入PD大鼠體內(nèi)后，磁共振示蹤觀察的可行性。方法：將45只帕金森病SD大鼠分為尾靜脈移植組、頸動(dòng)脈移植組和腦內(nèi)移植組，移植Feridex和5—溴脫氧尿核苷（BrdU）雙標(biāo)

9、記的BMSCs。另5只帕金森病SD大鼠為未治療對照組。移植后2、4、6、8周進(jìn)行阿樸嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)和MRI示蹤觀察，成像后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)每組處死2只大鼠，取腦組織冰凍切片后進(jìn)行普魯士藍(lán)染色及免疫組化染色。結(jié)果：尾靜脈移植組、頸動(dòng)脈移植組和腦內(nèi)移植組第4周阿樸嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)較未治療對照組有明顯減少；其中，腦內(nèi)移植組減少最明顯，優(yōu)于頸動(dòng)脈移植組和尾靜脈移植組。組織學(xué)和MRI示蹤發(fā)現(xiàn)移植的BMSCs在帕金森大鼠腦內(nèi)存活、遷移，免疫組化染色提示

10、移植的BMSCs在腦內(nèi)能向神經(jīng)細(xì)胞方向分化。結(jié)論：應(yīng)用BMSCs治療帕金森病大鼠療效顯著，菲立磁可以用來體外標(biāo)記骨髓基質(zhì)細(xì)胞，利用MRI技術(shù)可以對腦內(nèi)移植后的標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行初步的活體追蹤。 結(jié)論： 1．體外培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞，擴(kuò)增迅速，易純化，傳3代的細(xì)胞適合于細(xì)胞誘導(dǎo)分化，可作為帕金森病干細(xì)胞移植治療理想的細(xì)胞來源。 2．聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞因子可體外誘導(dǎo)BMSCs形成神經(jīng)干細(xì)胞，并向神經(jīng)元分化。 3．應(yīng)用6—OH

11、DA小劑量兩點(diǎn)毀損內(nèi)側(cè)前腦束制備的偏側(cè)帕金森病大鼠模型具有較高的成功率，是帕金森病研究較為理想的模型。 4．MRI掃描可以活體連續(xù)觀察帕金森病大鼠模型的毀損情況，是客觀評價(jià)和檢測帕金森病大鼠模型的一種有效工具。 5．應(yīng)用BMSCs移植治療帕金森病大鼠療效顯著，其中，紋狀體定向腦內(nèi)移植優(yōu)于頸動(dòng)脈移植和尾靜脈移植。 6．移植的BMSCs能在帕金森大鼠腦內(nèi)存活和遷移，并向神經(jīng)細(xì)胞方向分化。 7．菲立磁可以用來體