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文檔簡介
1、目的:帕金森病(parkinson’s disease,PD)是一種多發(fā)于中老年人的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,主要病理特點是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性壞死和紋狀體區(qū)多巴胺(dopamine,DA)水平減少。臨床上以進(jìn)行性加重的運動遲緩、肌強(qiáng)直、靜止性震顫、姿勢步態(tài)異常等為特征。近年來研究表明帕金森病患者不僅有運動障礙,而且有逐漸進(jìn)展的認(rèn)知功能下降,并伴有一定的焦慮、抑郁情緒,嚴(yán)重者出現(xiàn)癡呆,稱為帕金森病癡呆(Parkinson’s dis
2、ease with dementia,PDD),嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。傳統(tǒng)的藥物治療和外科手術(shù)方法只能部分改善癥狀,長期療效并不樂觀,而細(xì)胞移植已成為目前研究的熱點。骨髓基質(zhì)細(xì)胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSCs)取材方便,來源充足,可在短時間內(nèi)大量擴(kuò)增,并可進(jìn)行自體移植,避免了異體間移植可能引起的免疫排斥和倫理道德上的爭議,這些優(yōu)點均使其成為理想的種子細(xì)胞。腦內(nèi)注射6-羥基多巴胺(6-hydroxyd
3、opamine,6-OHDA)制作PD模型常用于研究PD的運動功能障礙及療效的觀察,近年來人們開始關(guān)注其認(rèn)知功能障礙。而目前研究多將BMSCs立體定向移植到6-OHDA所致PD模型大鼠的紋狀體,可有效改善大鼠的旋轉(zhuǎn)行為,但尚未見有側(cè)腦室移植BMSCs治療PD模型的報道。本研究將6-OHDA注射于單側(cè)黑質(zhì)致密部和腹側(cè)被蓋區(qū)制成PD模型,對PD模型運動和認(rèn)知兩方面的改變進(jìn)行觀察,并將同種異體來源的BMSCs在體外擴(kuò)增培養(yǎng)后,立體定向移植到6
4、-OHDA所致PD大鼠的側(cè)腦室,觀察側(cè)腦室移植BMSCs對PD大鼠的運動和認(rèn)知功能的影響。
方法:
①動物:封閉群清潔級健康雌性Sprague Dawley(SD)大鼠由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。
②實驗方法:正常成年SD大鼠60只,腹腔注射阿樸嗎啡(apomorphine,APO)淘汰有旋轉(zhuǎn)行為的大鼠1只,Morris水迷宮淘汰有記憶障礙的大鼠2只
5、后,隨機(jī)取8只大鼠歸入正常組,其余大鼠用水合氯醛麻醉,利用立體定向儀單側(cè)黑質(zhì)致密部和腹側(cè)被蓋區(qū)注射6-OHDA制作右側(cè)PD模型,手術(shù)后3周腹腔注射APO誘導(dǎo)其旋轉(zhuǎn),旋轉(zhuǎn)次數(shù)大于7r/min的視作制模成功。將成功的34只PD模型大鼠隨機(jī)分為BMSC組16只、PBS組10只、模型組8只。選取BMSC組大鼠右側(cè)側(cè)腦室(坐標(biāo):前囟后1.5mm,矢狀縫右側(cè)1.0mm,硬膜下3.8mm)為注射點,注入經(jīng)Brd-U標(biāo)記的BMSCs懸液10μl(約1.
6、0×106個細(xì)胞),PBS組同法于大鼠右側(cè)側(cè)腦室注入等量磷酸緩沖液(PBS),模型組和正常組不作任何處理。
③實驗評估:細(xì)胞移植后連續(xù)8周觀察APO誘導(dǎo)的PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為的變化;制模前、制模成功后(即細(xì)胞移植前)、細(xì)胞移植后第4周、細(xì)胞移植后第8周分別進(jìn)行Morris水迷宮測試,對各組大鼠的認(rèn)知功能進(jìn)行評價。側(cè)腦室移植后第1、3、7天及移植后8周各取兩只BMSC組大鼠,對腦側(cè)腦室區(qū)連續(xù)冠狀石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,檢測
7、BrdU陽性細(xì)胞。細(xì)胞移植后8周,取各組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)連續(xù)冠狀石蠟切片免疫組化染色檢測酪氨酸羥化酶(tvrosinehvdroxvlase.TH)陽性細(xì)胞。
結(jié)果:
①PD大鼠運動功能改變:與移植前比較,細(xì)胞移植后第1-8周腹腔注射APO誘導(dǎo)BMSC組PD大鼠的旋轉(zhuǎn)次數(shù)明顯減少,轉(zhuǎn)數(shù)從移植前的(13.5±4.9)r/min降到移植后第8周的(8.7±3.8)r/min,移植前后的數(shù)據(jù)相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<
8、0.05);PBS組和模型組移植前旋轉(zhuǎn)次數(shù)分別為(15.1±3.9)r/min、(17.8±3.4)r/min,移植后第8周分別為(18.1±4.0)r/min、(19.7±4.8)r/min,移植前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與PBS組和模型組比較,APO誘導(dǎo)BMSC組PD大鼠的旋轉(zhuǎn)次數(shù)從第1周開始就有明顯減少(P<0.05),從第3周即有顯著減少(P<0.01);PBS組和模型組各時間點比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
9、
②認(rèn)知功能改變:制作模型前,BMSC組、PBS組、模型組、正常組四組大鼠的尋臺潛伏期、在原平臺所在象限所占時間百分比、路程百分比、穿越平臺次數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。制模成功后即細(xì)胞移植前,與正常組相比,BMSC組、PBS組、模型組三組大鼠的尋臺潛伏期均顯著延長(P<0.05),在原平臺所在象限所占時間百分比、路程百分比、穿越平臺次數(shù)均顯著減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);而BM.SC組、PBS組、模型組三
10、組之間無差異(P>0.05)。細(xì)胞移植后第4周和細(xì)胞移植后第8周,BMSC組的尋臺潛伏期與PBS組、模型組相比顯著縮短(P<0.05),在原平臺所在象限所占時間百分比、路程百分比、穿越平臺次數(shù)均顯著增加(P<0.05),與正常組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);PBS組、模型組與正常組相比,尋臺潛伏期明顯延長(P<0.05),在原平臺所在象限所占時間百分比、路程百分比、穿越平臺次數(shù)均顯著減少(P<0.05);而模型組與PBS組相比
11、,上述指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05)。
③免疫組織化學(xué)染色結(jié)果:BMSC組在側(cè)腦室移植BMSC后第1天可見側(cè)腦室壁與脈絡(luò)叢存在大量BrdU陽性細(xì)胞,移植后第3天可見細(xì)胞沿胼胝體有少量遷移,移植后第7天依然可見脈絡(luò)叢中散在的陽性BrdU細(xì)胞,并且在胼胝體、腦室外側(cè)的周圍腦實質(zhì)均可見散在的陽性細(xì)胞,而在移植后8周時未見有明顯陽性細(xì)胞。移植后第8周BMSC組、PBS組、模型組的6-OHDA注射側(cè)黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元和神經(jīng)纖維
12、表達(dá)基本缺失。
結(jié)論:
①BMSC組移植后APO誘導(dǎo)的PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為從第1周即有明顯改善,并且可以持續(xù)至少8周。
②單側(cè)黑質(zhì)致密部和腹側(cè)被蓋區(qū)注射6-OHDA制成的PD模型大鼠有明顯的認(rèn)知障礙,主要表現(xiàn)在空間參考和空間工作記憶的下降。
③側(cè)腦室移植BMSCs可明顯改善6-OHDA所致PD大鼠的認(rèn)知功能障礙。
④BMSCs側(cè)腦室移植可存活并遷移至胼胝體和腦室外周的腦組
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