菲立磁對兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)活性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目前，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)病的治療目的多為緩解癥狀和控制疾病的發(fā)展。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在成年哺乳動物腦組織中存在神經(jīng)干細(xì)(neural stem cells，NSCs)，這些NSCs可以分化成神經(jīng)組織，表明CNS也存在再生修復(fù)能力，為研究CNS損傷的修復(fù)提出了希望。干細(xì)胞(stem cells，SCs)是指有多種分化潛能和自我更新能力的細(xì)胞，這種多潛能細(xì)胞存在于成年個體的許多組織和胚胎中。

2、近年來，隨著SCs研究的深入，骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrowderived stroma cells，BMSCs)被證明具有向NSCs分化的潛能，同時(shí)BMSCs還具有取材方便、來源廣泛、免疫原性低、遺傳性狀穩(wěn)定等優(yōu)勢，因此目前已成為SCs移植替代治療最理想的種子細(xì)胞來源之一，應(yīng)用NSCs特別是BMSCs源性NSCs分化調(diào)控和移植修復(fù)CNS功能亦成為研究重點(diǎn)。 到目前為止，不論是CNS還是周圍神經(jīng)系統(tǒng)(pnripheral

3、nervous system，PNS)疾病，絕大多數(shù)經(jīng)NSCs移植治療后，判斷其臨床癥狀的改善是否由移植細(xì)胞所致，以及移植后神經(jīng)再生的鑒定主要采用免疫組織化學(xué)的方法檢測。該方法必須獲取組織而不可能進(jìn)行活體評價(jià)，臨床及科研工作中渴望能無創(chuàng)性的對NSCs移植后的存活、遷徙及功能性分化進(jìn)行活體研究。 隨著超順磁性磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)對比劑的研制成功及MRI設(shè)備及方法的快速發(fā)展，為無

4、創(chuàng)傷性地在活體內(nèi)動態(tài)監(jiān)測移植后骨髓基質(zhì)細(xì)胞的存活、遷移、生存狀態(tài)等情況提供了可能。目前，MRI可以提供25～50μm的分辨率，接近單一細(xì)胞的水平，使其在理論上可以用來對移植的細(xì)胞進(jìn)行活體示蹤。氧化鐵類中的超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide，SPIO)和超小順磁性氧化鐵(ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO)是較為理想的MRI示蹤劑，已經(jīng)成功在體外

5、用于多種細(xì)胞的標(biāo)記。菲立磁(feridex，F(xiàn)E)是經(jīng)過美國食品及藥物管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)認(rèn)可的臨床上應(yīng)用的SPIO類 MRI 造影劑之一，借助轉(zhuǎn)染試劑多聚賴氨酸(poly-1-lysine，PLL)，F(xiàn)E已成功標(biāo)記多種哺乳動物SCs。目前國內(nèi)專家學(xué)者已經(jīng)開始了關(guān)于FE的試驗(yàn)研究，系統(tǒng)研究了大鼠、家兔及恒河猴的FE標(biāo)記BMSCs的培養(yǎng)及其向NSCs的轉(zhuǎn)化，向外傷動物模型的移植，利用M

6、RI影像學(xué)定位檢查標(biāo)記NSCs在腦內(nèi)的成活和遷移情況，并運(yùn)用免疫織組化學(xué)、透射電子顯微鏡等技術(shù)觀察NSCs生長、分化和突觸的形成及與腦組織整合情況，得到了肯定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但目前針對FE標(biāo)記前后BMSCs生物學(xué)活性的檢測，所做的研究還不夠完善，尚未見相關(guān)研究的系列報(bào)道。本課題擬在細(xì)胞水平，用不同濃度的FE特異性標(biāo)記BMSCs，并于體外對標(biāo)記前后的BMSCs活性、增殖、分化能力、凋亡等情況進(jìn)行研究，探索不同濃度FE對標(biāo)記BMSCs的影響及標(biāo)

7、記BMSCs的最佳濃度，為今后的進(jìn)一步研究工作提供技術(shù)參考。 第一章新西蘭兔BMSCs體外分離培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究 目的：觀察BMSCs體外培養(yǎng)、擴(kuò)增和誘導(dǎo)分化為 NSCs的情況，熟悉并掌握細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 方法： 1．以新西蘭大白兔為實(shí)驗(yàn)對象，無菌條件下行髂骨穿刺取骨髓，梯度密度離心法分離獲取新西蘭兔BMSCs。 2．骨髓源性NSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)及純化：原代培養(yǎng)第3天后，應(yīng)用

8、NSCs培養(yǎng)基，加入胎牛血清(FBS 1％終濃度)、白血病抑制因子(LIF 10ng/ml)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF 10ng/ml)進(jìn)行體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)、增殖。培養(yǎng)1～2周后得到較純化的BMSCs，可進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中加入FBS以及維甲酸(RA0.5μg/ml)以誘導(dǎo)BMSCs向NSCs分化。 3．CK-2型倒置相差光學(xué)顯微鏡追蹤觀察細(xì)胞生長情況并拍照。 4．免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定：采用SABC法，利用抗

9、神經(jīng)巢蛋白(Nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)等免疫細(xì)胞化學(xué)方法對BMSCs分化成的NSCs、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分別進(jìn)行特異性鑒定。 結(jié)果： 1．倒置相差顯微鏡觀察：接種后的10小時(shí)內(nèi)，BMSCs開始貼壁，貼壁細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后有分裂增殖，然后逐漸形成島嶼狀細(xì)胞克隆團(tuán)，給予適當(dāng)?shù)姆只瘲l件，10～20天后，這些細(xì)胞能分化成具有細(xì)長突起、多種形態(tài)的細(xì)胞。 2．經(jīng)免疫細(xì)胞化

10、學(xué)鑒定，早期的培養(yǎng)細(xì)胞在沒有給予誘導(dǎo)分化時(shí)可陽性表達(dá) Nestin，表明具有SCs特性，證實(shí)已經(jīng)形成BMSCs源性NSCs(BMSCs-D-NSCs)；培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后能分化出神經(jīng)元樣細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測可見有 NSE、GFAP的表達(dá)。 結(jié)論： 1．新西蘭大白兔的BMSCs能在體外培養(yǎng)和擴(kuò)增，具有增殖能力，能表達(dá)Nestin抗原，具有NSCs特征。 2．本實(shí)驗(yàn)所采用的培養(yǎng)方案(NSCs培養(yǎng)基

11、)適合于兔BMSCs向NSCs轉(zhuǎn)分化，源自BMSCs的 NSCs具有分化潛能，在合適的誘導(dǎo)分化條件下分化出的細(xì)胞能表達(dá)神經(jīng)系細(xì)胞(神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)的特征性抗原。 3．BMSCs來源豐富，體外分離、擴(kuò)增容易，可作為自體移植的種子細(xì)胞。 第二章 FE標(biāo)記新西蘭兔BMSCs的細(xì)胞生物學(xué)研究目的：初步探索利用不同濃度FE和轉(zhuǎn)染試劑特異性標(biāo)記新西蘭兔BMSCs，于體外對標(biāo)記前后的BMSCs活性、增殖、分化能力、凋亡等情況進(jìn)行

12、研究，探索FE標(biāo)記細(xì)胞的最佳濃度，為今后的進(jìn)一步研究工作提供技術(shù)參考。 方法： 1．實(shí)驗(yàn)動物和骨髓采集、BMSCs的分離擴(kuò)增同第一部分。 2．FE標(biāo)記細(xì)胞的濃度及分組：首先將FE分別稀釋成lOμg/ml、25μg/ml、50μg/ml和75μg/ml 四個不同濃度，并分別和PLL(1.5μg/ml)等體積混合，室溫下振蕩搖勻，30分鐘后將FE-PLL復(fù)合物(FE-PLL)加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，F(xiàn)E(Fe)和PLL的終

13、濃度分別為5μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、37.5μg/ml和0.75μg/ml。試驗(yàn)最后分組：a.純BMSC-D-NSC組；b.0.75PLL組；c．5FE-0.75PLL組；d．12.5FE-0.75PLL組；e．25FE-0.75PLL組；f.37.5FE-0.75PLL組(n=10)。 3．倒置顯微鏡和透射電鏡觀察：觀察各組標(biāo)記細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。 4．細(xì)胞內(nèi)鐵的鑒定：采用普魯士蘭染色和透射電鏡對

14、細(xì)胞內(nèi)鐵和標(biāo)記效率進(jìn)行檢測。 5．FE-PLL 標(biāo)記：BMSCs的滲漏性檢測：FE標(biāo)記標(biāo)記NSCs與神經(jīng)元共培養(yǎng)以檢測標(biāo)記細(xì)胞是否會發(fā)生FE的滲漏。 6．生長曲線的測定：采用CCK-8法鑒定各組細(xì)胞的活力。 7．流式細(xì)胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測凋亡：對細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行分析。 8．BMSCs標(biāo)記后細(xì)胞MRI：MRI掃描對象分為5組，4.7T MRI掃描序列包括軸面T<,2>快速自旋回波

15、(Fast spin echo，F(xiàn)SE)序列，T<,2>*梯度回波(Gradient echo，GRE)序列掃描。 9．統(tǒng)計(jì)分析：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，細(xì)胞吸光度及凋亡率數(shù)據(jù)均采用重復(fù)測量的方差分析進(jìn)行處理，組間兩兩比較采用SNK法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。 結(jié)論： 1．不同濃度FE-PLL復(fù)合物可以用來體外標(biāo)記新西蘭兔BMSCs。 2．隨FE濃度的增高，其標(biāo)記效率亦增高，且標(biāo)記后T<,2> WI或