NGF、Noggin基因修飾的rBMSCs移植治療帕金森病大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:1.通過(guò)立體定向技術(shù)將6-OHDA直接注射到前腦內(nèi)側(cè)束來(lái)建立一種簡(jiǎn)單、有效的PD大鼠模型，為下一步研究奠定基礎(chǔ)。2.建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、擴(kuò)增方法。3.判斷重組腺病毒Ad-GFP、Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-NOGGIN對(duì)rBMSCs的轉(zhuǎn)染效率、轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞的影響以及目的蛋白的表達(dá)情況。4.對(duì)比觀察化學(xué)誘導(dǎo)劑、NGF及Noggin對(duì)rBMSCs像神經(jīng)元樣細(xì)胞方向分化的誘導(dǎo)作用。5.探討攜帶NGF及Noggi n的

2、rBMSCs對(duì)PD模型大鼠神經(jīng)功能的修復(fù)作用及其機(jī)制。
　　 方法:1.應(yīng)用6-OHDA立體定向顱內(nèi)注射制備PD大鼠模型。用阿樸嗎啡皮下注射檢測(cè)造模是否成功。2.取SD大鼠長(zhǎng)骨骨髓作為供體來(lái)源，經(jīng)貼壁篩選法進(jìn)行體外培養(yǎng)并純化rBMSCs。通過(guò)細(xì)胞表面標(biāo)志、成骨細(xì)胞誘導(dǎo)和成脂細(xì)胞誘導(dǎo)對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。3.通過(guò)不同濃度的重組腺病毒選擇轉(zhuǎn)染最合適的MOI值。將rBMSCs分成5組分別為未轉(zhuǎn)染組、Ad-GFP轉(zhuǎn)染組、Ad-GFP-N

3、GF轉(zhuǎn)染組、Ad-GFP-Noggin轉(zhuǎn)染組和Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin聯(lián)合轉(zhuǎn)染組，觀察轉(zhuǎn)染對(duì)rBMSCs生長(zhǎng)的影響，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。4.通過(guò)化學(xué)誘導(dǎo)劑和基因修飾誘導(dǎo)rBMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞方向分化，并檢測(cè)其神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。5.通過(guò)立體定向顱內(nèi)注射將經(jīng)過(guò)基因修飾的rBMSCs移植入模型大鼠損毀側(cè)紋狀體。記錄單位時(shí)間阿樸嗎啡誘發(fā)的模型大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)，觀察大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況。通過(guò)免疫熒光檢測(cè)移植

4、細(xì)胞在腦內(nèi)存活、分布以及向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞方向分化的情況。免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞移植后第四周大鼠中腦黑質(zhì)TH陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。通過(guò)高效液相檢測(cè)大鼠紋狀體DA、DOPAC、HVA含量。
　　 結(jié)果:1.6-OHDA顱內(nèi)注射制備的帕金森病大鼠模型具有良好的穩(wěn)定性，該模型的制備為下一步實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。2.貼壁法能夠篩選獲得純度較高，活性良好的rBMSCs，具有相關(guān)表型，能向成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞分化。3.重組腺病毒Ad-GFP、Ad-GFP-

5、NGF、Ad-GFP-Noggin在MOI=50pfu/cell條件下對(duì)rBMSCs轉(zhuǎn)染效率高，對(duì)rBMSCs毒性最小。經(jīng)NGF、Noggin修飾的重組腺病毒轉(zhuǎn)染后的rBMSCs在發(fā)出綠色熒光的同時(shí)，能分別表達(dá)相應(yīng)蛋白產(chǎn)物，免疫熒光染色呈紅色熒光。聯(lián)合轉(zhuǎn)染組rBMSCs則同時(shí)呈現(xiàn)NGF、Noggin免疫熒光陽(yáng)性反應(yīng)。4.rBMSCs在化學(xué)誘導(dǎo)劑作用下，5h后出現(xiàn)神經(jīng)元樣形態(tài)，免疫熒光染色顯示神經(jīng)元標(biāo)志物NF（H）呈陽(yáng)性，星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志

6、物GFAP呈陰性，但細(xì)胞大量死亡。各轉(zhuǎn)染組rBMSCs中Ad-GFP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞形態(tài)無(wú)改變，Ad-GFP-NGF轉(zhuǎn)染組、Ad-GFP-Noggin轉(zhuǎn)染組及聯(lián)合轉(zhuǎn)染組rBMSCs在轉(zhuǎn)染后72h呈現(xiàn)神經(jīng)元樣形態(tài)，部分細(xì)胞免疫熒光染色顯示NF（H）陽(yáng)性，GFAP陰性，分化后的細(xì)胞可長(zhǎng)期存活。其中聯(lián)合轉(zhuǎn)染組NF（H）陽(yáng)性率最高。5.經(jīng)立體定向?qū)⒓?xì)胞移植入模型大鼠損毀側(cè)紋狀體一周后，大鼠神經(jīng)功能均有所改善，由阿樸嗎啡誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)明顯減少，其中聯(lián)合

7、轉(zhuǎn)染組最為明顯。鏡下發(fā)現(xiàn)，移植細(xì)胞自注射部位向周?chē)鷶U(kuò)散，分布于紋狀體、皮層下、海馬及對(duì)側(cè)半球。移植后兩周，免疫熒光檢測(cè)部分存活移植細(xì)胞NF（H）有陽(yáng)性表達(dá)，另有部分細(xì)胞呈GFAP陽(yáng)性。聯(lián)合轉(zhuǎn)染組NF（H）和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞比例最高。移植后四周，免疫組化檢測(cè)各組模型黑質(zhì)TH陽(yáng)性細(xì)胞生存率，基因修飾組有增多的趨勢(shì)，但各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高效液相檢測(cè)大鼠紋狀體DA、DOPAC、HVA含量損毀側(cè)同健側(cè)之比，各細(xì)胞移植組比值均較未移植組和PBS

8、組高，其中Ad-GFP-NGF和Ad-GFP-Noggin聯(lián)合轉(zhuǎn)染組比值最高。
　　 結(jié)論:1.6-OHDA立體定向顱內(nèi)注射法制備PD大鼠模型具有良好的穩(wěn)定性及可重復(fù)性。2.通過(guò)貼壁篩選法能有效純化骨髓，獲得高純度rBMSCs，并且該方法簡(jiǎn)單實(shí)用，對(duì)細(xì)胞影響小，能滿足大多數(shù)研究需求。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志，以及成骨、成脂誘導(dǎo)能夠?qū)BMSCs進(jìn)行有效鑒定。3.重組腺病毒Ad-GFP、Ad-GFP-NGF和Ad-GFP-

9、Noggin均能安全、有效地轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs，并穩(wěn)定表達(dá)GFP、NGF和Noggin蛋白。4.體外環(huán)境下，化學(xué)誘導(dǎo)劑和NGF和Noggin蛋白均能將rBMSCs誘導(dǎo)成為神經(jīng)元樣細(xì)胞，但化學(xué)誘導(dǎo)劑對(duì)細(xì)胞存活有明顯影響，而后兩者不影響細(xì)胞存活，并可促進(jìn)細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化。5.立體定向?qū)⒒蛐揎椀膔BMSCs移植入大鼠損毀側(cè)紋狀體，移植細(xì)胞可在腦內(nèi)存活、遷移并分化為具有神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞表型的細(xì)胞，通過(guò)多種途徑有效改善模型大鼠