TH-GDNF基因修飾的胚胎干細胞治療帕金森病模型大鼠的實驗研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見于中老年人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其主要病理學改變是黑質(zhì)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元變性壞死，紋狀體內(nèi)DA能神經(jīng)遞質(zhì)匱乏。PD的發(fā)病機制目前仍不清楚，因此至今尚無滿意的治療方法。理想的PD治療方法應該不僅能糾正腦內(nèi)DA含量的不足，還要保護殘存的DA能神經(jīng)元。目前認為，干細胞移植結(jié)合基因治療可能是實現(xiàn)這一目標的最佳途徑之一。胚胎干(embryonic stem，

2、ES)細胞因具有在體外無限或較長期增殖和多向分化潛能而成為早期胚胎發(fā)育研究和細胞治療的良好來源。傳統(tǒng)的PD基因治療主要有兩條途徑：通過將促進DA合成的相應酶基因如酪氨酸羥化酶(tyrosinehydroxylase，TH)引入紋狀體，以提高紋狀體內(nèi)DA含量；或者通過將神經(jīng)營養(yǎng)因子基因如膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF)引入黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)，阻止DA能

3、神經(jīng)元凋亡，維持其存活和促進其功能修復，使受損的DA能神經(jīng)元有可能重建和恢復功能。若同時給予GDNF基因和TH基因，可能達到防治兼?zhèn)涞哪康?，應該是目前PD基因治療的理想策略。 本研究采用了分子克隆、細胞培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染等研究方法，分別將小鼠GDNF基因和人源性TH基因克隆到真核表達質(zhì)粒載體plRES的上下游，構(gòu)建出pIRES-TH-GDNF。將此功能載體轉(zhuǎn)染分化的大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(differentiated PC12，d

4、PC12)，檢測了轉(zhuǎn)染該基因的dPC12拮抗MPP<'+>損傷的作用。然后將此功能載體pIRES-TH-GDNF轉(zhuǎn)染小鼠ES細胞，并將攜帶TH和GDNF基因的ES(TH-GDNF-ES)細胞和ES細胞分別植入6-羥基多巴胺(6-hydoxydopamine，6-OHIDA)損傷的PD模型大鼠紋狀體、黑質(zhì)和同時植入黑質(zhì)及紋狀體(雙移植)。通過觀察大鼠行為學改變和移植細胞分化成TH陽性神經(jīng)元的情況，以了解ES細胞或TH-GDNF-ES細胞對

5、PD大鼠的治療作用。并將逆行追蹤劑熒光金(Fluo-Gold，F(xiàn)G)注射入損毀側(cè)紋狀體，觀察DA神經(jīng)通路的重建，以尋找PD細胞移植及基因治療的最佳途徑。 實驗結(jié)果如下： 1、構(gòu)建了雙基因表達的plRES-TH-GDNF載體，酶切鑒定及測序結(jié)果證實其是正確的。 2、將pIRES-TH-GDNF轉(zhuǎn)染dPC12和ES細胞，經(jīng)G418篩選后，得到了穩(wěn)定表達TH和GDNF的dPC12和ES細胞。用RT-PCR和細胞免疫熒光

6、等方法能檢測出TH和GDNF在細胞中轉(zhuǎn)錄和表達。 3、MTT。法檢測細胞存活率顯示：未轉(zhuǎn)染pIRES-TlH-GDNF的dPC12細胞在25 μ M的MPP<'+>作用下，細胞存活率明顯下降；而轉(zhuǎn)染TH-GDNF基因的細胞在100 μ M濃度的MPP<'+>作用下，細胞存活率才出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染后的dPC12能很好的對抗MPP<'+>毒性作用。 4、免疫組織化學結(jié)果顯示：ES細胞及TH-GDNF-ES

7、細胞植入6-OHDA損傷側(cè)的紋狀體及黑質(zhì)后細胞存活狀態(tài)較好，部分細胞分化為TH陽性神經(jīng)元。與ES細胞移植組相比，TH-GDNF-ES細胞移植組生成的TH陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯增多(P<0.05)。 5、行為檢測結(jié)果顯示：移植后4～8w，ES細胞移植(紋狀體、黑質(zhì)、紋狀體+黑質(zhì))組及TH-GDNF-ES細胞移植(黑質(zhì))組PD大鼠的旋轉(zhuǎn)行為與對照組相比無明顯改善(P>0.05)。而TH-GDNF-ES細胞移植(紋狀體、紋狀體+黑質(zhì))組P

8、D大鼠的旋轉(zhuǎn)行為與對照組相比明顯改善(P<0.05)，但TH-GDNF-ES細胞移植(紋狀體)組與TH-GDNF-ES細胞移植(紋狀體+黑質(zhì))組相比差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 6、HPLC檢測結(jié)果顯示，移植后8w，與對照組相比，ES細胞移植(紋狀體、黑質(zhì)、紋狀體+黑質(zhì))組及TH-GDNF-ES細胞移植(黑質(zhì))組PD大鼠紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物3,4二羥基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid

9、，DOPAC)含量無明顯增高(P>0.05)。而TH-GDNF-ES細胞移植(紋狀體、紋狀體+黑質(zhì))組PD大鼠紋狀體內(nèi)DA及DOPAC含量明顯增高(P<0.05)。但TH-GDNF-ES細胞移植(紋狀體)組與TH-GDNF-ES細胞移植(紋狀體+黑質(zhì))組相差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 7、FG注射紋狀體2w后，在TH-GDNF-ES細胞移植(紋狀體+黑質(zhì))組PD大鼠同側(cè)的黑質(zhì)中觀察到有FG逆行標記的TH陽性神經(jīng)元。

10、 上述結(jié)果表明，我們成功構(gòu)建了雙基因表達的pIRES-TH-GDNF載體，其攜帶的功能基因(TH和GDNF)導入到dPC12和ES細胞內(nèi)，隨細胞分裂而進入子代細胞并能高效表達，且在dPC12細胞內(nèi)起到對抗MPP<'+>毒性的作用；ES細胞及TH-GDNF-ES細胞移植到6-OHDA制備的PD大鼠紋狀體及黑質(zhì)后細胞存活狀態(tài)較好，并分化成TH陽性神經(jīng)元；TH-GDNF-ES細胞移植(紋狀體、紋狀體+黑質(zhì))可增加PD大鼠紋狀體的DA及DOP