NGF、Noggin基因修飾的rBMSCs對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死大鼠的作用.pdf

1、研究目的：1.建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、擴(kuò)增方法，為下一步研究奠定基礎(chǔ)。2.判斷重組腺病毒Ad-GFP、Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin對(duì)rBMSCs的轉(zhuǎn)染效率、轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞的影響以及目的蛋白的表達(dá)情況。3.對(duì)比觀察化學(xué)誘導(dǎo)劑、NGF和/或Noggin對(duì)rBMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞方向分化的誘導(dǎo)作用。4.探討攜帶NGF和/或Noggin的rBMSCs對(duì)MCAO動(dòng)物模型神經(jīng)功能的修復(fù)作用及其機(jī)制。 研究方法：1

2、.取SD大鼠長(zhǎng)骨骨髓作為供體來(lái)源，經(jīng)貼壁篩選法進(jìn)行體外培養(yǎng)并純化rBMSCs。通過(guò)細(xì)胞表面標(biāo)志、成骨細(xì)胞誘導(dǎo)和成脂細(xì)胞誘導(dǎo)分化鑒定獲得的細(xì)胞為高純度的BMSC。2.通過(guò)重組腺病毒的濃度梯度選擇轉(zhuǎn)染最適MOI值。將rBMSCs分5組，分別為未轉(zhuǎn)染組、Ad-GFP轉(zhuǎn)染組、Ad-GFP-NGF轉(zhuǎn)染組、Ad-GFP-Noggin轉(zhuǎn)染組和Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin聯(lián)合轉(zhuǎn)染組。通過(guò)MTT法判斷轉(zhuǎn)染對(duì)rBMSCs的影響，免疫熒光

3、和Westernblot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。3.通過(guò)化學(xué)誘導(dǎo)劑和基因修飾誘導(dǎo)rBMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞方向分化，并檢測(cè)其神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)。4.線栓法制作大鼠MCAO模型。造模后5天，經(jīng)股靜脈移植入各種基因修飾的BMSC。mNSS評(píng)分觀察動(dòng)物神經(jīng)功能恢復(fù)情況，免疫熒光染色檢測(cè)移植細(xì)胞在腦內(nèi)存活、分布以及向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞分化情況，免疫組化方法檢測(cè)移植后缺血周邊腦組織中VEGF和突觸素表達(dá)情況。 結(jié)果：1.貼壁篩選法獲

4、得的細(xì)胞具有rBMSCs表型，能向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化，并且經(jīng)反復(fù)貼壁傳代能獲得純度較高，活性良好的rBMSCs。2.重組腺病毒Ad-GFP、Ad-GFP-NGF和Ad-GFP-Noggin在MOI=50pfu/cell條件下對(duì)rBMSCs轉(zhuǎn)染效率高，對(duì)rBMSCs毒性最小。經(jīng)重組腺病毒轉(zhuǎn)染后的BMSC能發(fā)出綠色熒光，未轉(zhuǎn)染組和Ad-GFP轉(zhuǎn)染組少量表達(dá)NGF，不表達(dá)Noggin。Ad-GFP-NGF、Ad-GFP-Noggin分別轉(zhuǎn)

5、染rBMSCs后經(jīng)相應(yīng)蛋白免疫熒光染色呈現(xiàn)紅色熒光，Westernblot顯示各轉(zhuǎn)染組rBMSCs在相應(yīng)蛋白分子量處出現(xiàn)蛋白條帶。聯(lián)合轉(zhuǎn)染組rBMSCs同時(shí)呈現(xiàn)NGF、Noggin免疫熒光陽(yáng)性反應(yīng)，Westernblot在26、140處同時(shí)出現(xiàn)蛋白條帶。3.rBMSCs經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)5h后出現(xiàn)神經(jīng)元樣形態(tài)，免疫熒光染色顯示神經(jīng)元標(biāo)志物NF(H)呈陽(yáng)性，星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP呈陰性，但48h后細(xì)胞全部死亡。各轉(zhuǎn)染組rBMSCs中Ad

6、-GFP轉(zhuǎn)染組細(xì)胞形態(tài)無(wú)改變，Ad-GFP-NGF轉(zhuǎn)染組、Ad-GFP-Noggin轉(zhuǎn)染組及聯(lián)合轉(zhuǎn)染組rBMSCs在轉(zhuǎn)染后24h呈現(xiàn)神經(jīng)元樣形態(tài)，部分細(xì)胞免疫熒光染色呈NF(H)陽(yáng)性，GFAP陰性，并且分化后神經(jīng)元樣細(xì)胞可大量增殖，長(zhǎng)期存活。其中聯(lián)合轉(zhuǎn)染組NF(H)陽(yáng)性率最高。4.線栓法制作的大鼠MCAO模型梗塞對(duì)側(cè)肢體癱瘓，TTC染色梗塞區(qū)不著色，HE染色呈缺血性病理改變。攜帶不同基因的rBMSCs靜脈移植3w后各組動(dòng)物神經(jīng)功能均有不

7、同程度改善，其中聯(lián)合轉(zhuǎn)染組mNSS評(píng)分最低。移植后3w梗塞周邊有移植細(xì)胞存活，免疫熒光檢測(cè)部分存活移植細(xì)胞為NF(H)陽(yáng)性，另有部分細(xì)胞為GFAP陽(yáng)性。其中聯(lián)合移植組存活細(xì)胞最多，NF(H)陽(yáng)性和GEAP陽(yáng)性細(xì)胞比例最大。而各細(xì)胞移植組中GFAP+/GFP+細(xì)胞比例均高于NF(H)+/GFP+細(xì)胞比例。細(xì)胞移植后3w，各移植組梗塞周邊腦組織VEGF和突觸索表達(dá)均較未移植組和PBS注射組高，而聯(lián)合移植組中兩者的表達(dá)最明顯。 結(jié)論：

8、1.通過(guò)貼壁篩選法能有效純化骨髓，獲得高純度rBMSCs，并且該方法簡(jiǎn)單實(shí)用，對(duì)細(xì)胞活性影響小，能滿足大多數(shù)研究需求。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志，以及成骨、成脂誘導(dǎo)，能夠?qū)BMSCs進(jìn)行有效鑒定。2.重組腺病毒Ad-GFP、Ad-GFP-NGF和Ad-GFP-Noggin均能安全轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠rBMSCs，并持續(xù)、高效表達(dá)GFP、NGF和Noggin蛋白。Ad-GFP-NGF和Ad-GFP-Noggin聯(lián)合移植rBMSCs的

9、方法安全、有效。3.體外環(huán)境下，化學(xué)誘導(dǎo)劑和NGF、Noggin蛋白都能將rBMSCs誘導(dǎo)成為神經(jīng)元樣細(xì)胞，但化學(xué)誘導(dǎo)劑對(duì)細(xì)胞存活有明顯影響，而后兩者可促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活，并且兩種基因同時(shí)表達(dá)可進(jìn)一步促進(jìn)rBMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞方向分化。4.線栓法制作大鼠MCAO模型能有效模擬人類腦梗塞的病理改變。靜脈移植不同基因修飾的rBMSCs，特別是NGF和Noggin聯(lián)合修飾的rBMSCs能有效改善MCAO大鼠神經(jīng)功能活動(dòng)。移植細(xì)胞能在梗塞區(qū)