人全長survivin基因修飾DCs疫苗的構(gòu)建及其對乳腺癌作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、乳腺癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，采用傳統(tǒng)的治療方法盡管顯示一定的治療效果，但目前仍存在預(yù)后較差，生存率較低，如何改善其預(yù)后、提高生存率是目前臨床上亟待解決的關(guān)鍵問題之一。近年來，由于樹突狀細(xì)胞(DCs)具有體內(nèi)強(qiáng)大的抗原遞呈及免疫激發(fā)能力，因此針對DCs的生物治療疫苗給乳腺癌的治療帶來了新的曙光。以往的DCs疫苗多采用乳腺癌細(xì)胞融合、乳腺癌細(xì)胞粗提抗原或乳腺癌相關(guān)蛋白多肽負(fù)載DCs等方法來構(gòu)建，這些方法所能獲得的乳腺癌抗原量較低，刺激

2、DCs激發(fā)后續(xù)抗乳腺癌免疫應(yīng)答能力較弱。為提高DCs抗原遞呈及免疫激發(fā)能力，實(shí)現(xiàn)對乳腺癌更有效的生物治療效應(yīng)，針對人全長survivin基因在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常組織中未見表達(dá)，以人survivin抗原作靶抗原來刺激增強(qiáng)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞免疫攻擊能力，可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，同時(shí)能避免自身免疫反應(yīng)。本研究采用基因克隆及重組等技術(shù)，用重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染人全長Survivin基因修飾DCs，希望能促進(jìn)DCs表面分子上調(diào)并且實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)

3、，加強(qiáng)其激活殺傷性T淋巴細(xì)胞增殖能力，實(shí)現(xiàn)強(qiáng)而有效的抗乳腺癌作用。同時(shí)，通過對所構(gòu)建疫苗生物學(xué)特性及其對乳腺癌治療作用的初步觀察，希望能為乳腺癌DCs疫苗治療提供新的思路和理論依據(jù)。 方法：第一部分：人全長Survivin基因重組腺病毒載體構(gòu)建及鑒定。首先采用DNA重組技術(shù)，將人全長survincDNA插入pAdTrack-CMV質(zhì)粒中，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pAdTrack-survivin，經(jīng)酶切、測序等方法鑒定目的基因連接成功后，再

4、將此穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到DH5α細(xì)菌中擴(kuò)增；然后將該穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1共轉(zhuǎn)染BJ5183細(xì)胞，在其中通過同源重組構(gòu)建重組人全長survivin-腺病毒載體(Ad-survivin)，經(jīng)酶切鑒定后在XL-Gold菌中擴(kuò)增，提取質(zhì)粒純化并將其轉(zhuǎn)入293細(xì)胞中包裝、擴(kuò)增病毒。細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測出survivinmRNA表達(dá)。并通過濃縮離心、制備滴度高達(dá)1.65×108PFU/ml的病毒Ad-Survivin。 第二部

5、分：人全長survivin基因修飾DCs疫苗構(gòu)建及鑒定：首先從臍血獲取單個核細(xì)胞，采用貼壁培養(yǎng)篩選方法，利用rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-a體外定向誘導(dǎo)分化，用重組腺病毒pAd-sur轉(zhuǎn)染未成熟DCs，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲取成熟DCs，經(jīng)倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征；流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表型；通過RT-PCR檢測鑒定DCs攜帶了人全長survivin基因；由Westernblot檢測用人全長survivin基因修飾DCs

6、疫苗中是否有survivin蛋白表達(dá)。 第三部分：人全長survivin基因修飾DCs疫苗生物學(xué)活性及對乳腺癌作用觀察：用3H-TdR摻入T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)觀察人全長survivin基因修飾DCs疫苗激活T淋巴細(xì)胞的增殖能力；用ELISA法觀察不同組DCs疫苗和T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)上清中γ-IFN釋放分泌情況；采用MTT比色法檢測不同組DCs疫苗體外殺傷乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用；流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV/PI雙標(biāo)法觀察疫苗對乳腺癌

7、移植瘤細(xì)胞凋亡的影響；光鏡下觀察疫苗對腫瘤組織病理學(xué)形態(tài)改變的影響。 結(jié)果：1.通過基因克隆和重組技術(shù)，成功地構(gòu)建了攜帶人全長survivin基因的重組腺病毒載體pAd-sur。 2.通過對臍血來源的單個核細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化，獲得具備典型特征的DCs，其表面分子表達(dá)水平可達(dá)CD1a46.2±4.3％、CD8064.2±2.7％、CD8380.5±2.2％、HLA-DR84.3±3.8％，將pAd-sur-DCs組與pA

8、d對照組及單純DCs組比較，可見pAd-sur-DCs組能刺激DCs表面分子表達(dá)增高，與對照組比較有顯著差異；通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)僅pAd-sur-DCs組中有survivinmRNA表達(dá)，兩對照組無survivinmRNA表達(dá)，Western-blot檢測pAd-sur-DCs組survivin蛋白表達(dá)陽性。 3.T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)：重組pAd-sur-DCs疫苗刺激T淋巴細(xì)胞增殖CPM值為7919±854，而空載病毒對照

9、組CPM值為4997±479，單純DCs對照組CPM值為4510±439，幾組比較發(fā)現(xiàn)用survivin基因修飾的DCs能顯著刺激T淋巴細(xì)胞增殖；通過ELISA法檢測三組DCs刺激T淋巴細(xì)胞分泌γ-IFN能力，發(fā)現(xiàn)pAd-sur-DCs能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞γ-IFN分泌增加，與對照組比較差異顯著； 4.體外MTT比色檢測，Survivin基因修飾疫苗通過激活CTL細(xì)胞體外對乳腺癌MCF-7細(xì)胞殺傷率(51.46±7.23％)，與空載

10、病毒對照組(28.42±3.05％)及單純DCs細(xì)胞對照組(21.24±1.48％)比較，差異非常顯著；基因修飾疫苗組移植瘤細(xì)胞凋亡率為54.9±1.38％，壞死率為21.87±0.73％，與對照組比較，差異非常顯著； 結(jié)論：1.重組腺病毒轉(zhuǎn)染DCs能夠獲得高效率的表達(dá)，構(gòu)建周期短，方法簡便； 2.體外分離培養(yǎng)的臍血單個核細(xì)胞經(jīng)rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-a等細(xì)胞因子誘導(dǎo)后，可以獲得具有典型形態(tài)學(xué)特征及細(xì)