重組復(fù)合高效干擾素對人乳腺癌細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及目的：乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在我國女性惡性腫瘤中居第二位，且呈明顯上升的趨勢，尤其在一些沿海發(fā)達(dá)地區(qū)，如上海市，其發(fā)病率在2000年已躍居女性惡性腫瘤發(fā)病率之首。乳腺癌作為全身性疾病，其治療絕非單一療法所能奏效，除了手術(shù)、放療等局部治療手段，還需結(jié)合化療、內(nèi)分泌治療、免疫治療等全身綜合治療措施。盡管化療的應(yīng)用使得乳腺癌生存率顯著提高，但其不可忽視的副反應(yīng)，嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量，越來越多的腫瘤耐藥性的形成

2、，大大降低了其療效。因此，如何在保證患者生存質(zhì)量的前提下盡可能地提高療效，延長患者的生命，這樣一個(gè)命題就不可避免地?cái)[到醫(yī)療工作者的面前。干擾素(IFN)作為目前研究最多、唯一具有抗病毒和抗腫瘤雙重作用的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，越來越受到重視。IFN通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，阻遏癌基因的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化、調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫系統(tǒng)及抗腫瘤血管形成等方面殺傷腫瘤細(xì)胞，且IFN與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)能明顯提高化療藥物的抗腫瘤活性。另有研究發(fā)現(xiàn)，IFN對腫瘤

3、細(xì)胞表面的MDR-1表型有逆轉(zhuǎn)作用。對有耐藥腫瘤的病人在化療前先使用IFN，可競爭性地結(jié)合P-糖蛋白，以克服多藥耐藥性。重組高效復(fù)合干擾素(以下簡稱rSIFN-CO)是通過比較22種天然人體包括α、β、ω等干擾素在內(nèi)的多肽鏈氨基酸序列，并測定其活性單位結(jié)構(gòu)，以相應(yīng)位點(diǎn)之氨基酸出現(xiàn)頻度及活性結(jié)構(gòu)單位設(shè)計(jì)的一組全新氨基酸序列，然后再根據(jù)大腸桿菌密碼子偏愛性設(shè)計(jì)出新的人工基因序列。它與臨床上使用的重組復(fù)合干擾素-干復(fù)津的氨基酸序列是一致的(N

4、-L-亞甲基-22-L-精氨酸-76-L-丙氨酸-78-L-天門冬氨酸-79-L-谷氨酸-86-L-酪氨酸-90-L-酪氨酸-156-L-天門冬酰胺-158-L-亮氨酸干擾素-α-1)，由于采用了全新的純化工藝，使rSIFN-co的蛋白質(zhì)空間構(gòu)象發(fā)生了改變，令其具有更強(qiáng)的抗病毒作用及極低的副作用。目前關(guān)于此類復(fù)合干擾素應(yīng)用于抗腫瘤的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探討rSIFN-co抗乳腺癌細(xì)胞、逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐化療藥物細(xì)胞株耐藥性的生物學(xué)活性，以

5、及與抗腫瘤藥物合用后的協(xié)同抗腫瘤作用。 方法： 1．采用MTT比色法和流式細(xì)胞儀技術(shù)，研究重組高效復(fù)合干擾素rSIFN-co、干復(fù)津、表柔比星對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞及人乳腺癌阿霉素耐藥株MCF-7/ADR細(xì)胞增殖、凋亡的影響，及rSIFN-co與化療藥物表柔比星合用后的協(xié)同抗腫瘤作用。 2．采用免疫組化SABC法檢測經(jīng)過rSIFN-co、干復(fù)津、表柔比星單用或聯(lián)合處理的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞及人乳腺癌阿霉素耐藥

6、株MCF-7/ADR細(xì)胞中P53、Bcl-2、CerbB-2、P-gp的表達(dá)水平。 結(jié)果： 1．細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果：空白對照組細(xì)胞貼壁均勻，狀態(tài)良好，各干預(yù)組貼壁細(xì)胞明顯減少，培養(yǎng)液內(nèi)細(xì)胞碎片增多，且隨著藥物劑量的增加和干預(yù)時(shí)間的延長更明顯。 2.四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色試驗(yàn)結(jié)果：對MCF-7細(xì)胞，各干預(yù)組OA值較空白對照組顯著降低，其增殖抑制率與藥物劑量、干預(yù)時(shí)間成正比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且相同劑量的rSIFN

7、-co較干復(fù)津?qū)CF-7細(xì)胞抑制率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。聯(lián)合使用rSIFN-co+表柔比星及干復(fù)津+表柔比星，有一定的協(xié)同增強(qiáng)作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對.MCF-7/ADR細(xì)胞，相對較低濃度的表柔比星對MCF-7/ADR細(xì)胞抑制作用甚微：50μg/ml表柔比星作用48h后，其抑制率仍在20％左右。而最小劑量0.02μg/ml的rSIFN-co作用48h后，其抑制率達(dá)到了34％，且聯(lián)合rSIFN-co+表柔比星(15μg/ml)有協(xié)同

8、增強(qiáng)的抑制作用，聯(lián)合使用72小時(shí)后協(xié)同作用更顯著，5μg/ml rSIFN-co+15μg/ml表柔比星作用72h后抑制率達(dá)到了88.68％。干復(fù)津與rSIFN-co相比其抑制作用相對較弱，且與表柔比星的協(xié)同作用不顯著。 3.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果：與空白對照組相比，作用48h后，單用0.05μg/ml的表柔比星對MCF-7腫瘤細(xì)胞的凋亡無明顯影響，單用15μg/ml表柔比星對MCF-7/ADR細(xì)胞凋亡亦無顯著作用。單用5μg/ml

9、的rSIFN-co、干復(fù)津或聯(lián)合使用rSIFN-co+表柔比星、干復(fù)津+表柔比星后凋亡率較對照組顯著增加，且rSIFN-co、干復(fù)津與表柔比星聯(lián)用對凋亡均有協(xié)同增強(qiáng)的作用，但rSIFN-co+表柔比星優(yōu)于干復(fù)津+表柔比星。 4.免疫組化結(jié)果：各藥物處理MCF-7細(xì)胞48h后，rSIFN-co及rSIFN-co+表柔比星均能下調(diào)P53、CerbB-2蛋白及上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。聯(lián)合使用干

10、復(fù)津+表柔比星可下調(diào)P53、CerbB-2蛋白及上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但單用干復(fù)津?qū)erbB-2表達(dá)無明顯影響。rSIFN-co與干復(fù)津相比，rSIFN-co作用更強(qiáng)。各藥物處理MCF-7/ADR細(xì)胞48h后，rSIFN-co組及rSIFN-co+表柔比星組均能下調(diào)P53、CerbB-2、P-gp蛋白及上調(diào).Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。干復(fù)津能下調(diào)P53、P

11、-gp的表達(dá)及上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，但對CerbB-2的表達(dá)水平無影響，聯(lián)合使用干復(fù)津+表柔比星能下調(diào)P53、CerbB-2蛋白及上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，但對P-gp表達(dá)的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。除P53蛋白外，rSIFN-co對其余三種蛋白的表達(dá)變化均較干復(fù)津強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1.rSIFN-co和干復(fù)津均能抑制人乳腺癌MCF-7敏感株及阿霉素耐藥株細(xì)胞的生長，而且有時(shí)間和劑量依賴性，相同劑量的rSIFN

12、-co較干復(fù)津的抑制作用更強(qiáng)。 2.rSIFN-co和干復(fù)津抑制人乳腺癌MCF-7敏感株及阿霉素耐藥株細(xì)胞的生長與促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡有關(guān)，相同劑量的rSlFN-co較干復(fù)津具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡的作用。 3.rSIFN-co抑制人乳腺癌MCF-7敏感株及阿霉素耐藥株細(xì)胞的生長與其降低增殖相關(guān)因子水平有關(guān)。 4.rSIFN-co和干復(fù)津增強(qiáng)表柔比星對人乳腺癌MCF-7耐藥株細(xì)胞的生長抑制作用與其下調(diào)耐藥蛋白P-gp的表達(dá)水