REGγ在人乳腺癌中作用的研究.pdf

1、目的：探討在人乳腺癌細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞中REGγ的表達(dá)情況。 方法：采用免疫細(xì)胞化學(xué)和western blotting等方法檢測(cè)RECγ在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231與乳腺上皮細(xì)胞株HBL-100中的表達(dá)情況。 結(jié)果：①REGγ在乳腺癌細(xì)胞株與乳腺上皮細(xì)胞株的表達(dá)水平上有明顯差異，2株乳腺癌細(xì)胞的REGγ表達(dá)明顯高于乳腺上皮細(xì)胞株（P<0.05）。②在2株乳腺癌細(xì)胞株中，MDA-MB-231的REGγ高于

2、MCF-7（P<0.05）。 結(jié)論：在乳腺癌細(xì)胞株中REGγ的表達(dá)明顯高于乳腺上皮細(xì)胞株；乳腺癌細(xì)胞株中，惡性潛能高的細(xì)胞株REGγ的表達(dá)強(qiáng)于惡性潛能低的細(xì)胞株。 目的:研究REGγ在乳腺癌組織、良性腫瘤組織及癌旁乳腺組織的表達(dá)及意義，以及人乳腺癌組織中REGγ的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。 方法:應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定REGγ在乳腺癌組織、良性腫瘤組織及癌旁乳腺組織的表達(dá)情況。 結(jié)果:①REGγ在乳腺癌

3、組織，良性腫瘤（纖維腺瘤）及癌旁乳腺組織的表達(dá)水平上結(jié)果差別有明顯差異，乳腺癌組織的REGγ表達(dá)明顯高于良性腫瘤及癌旁乳腺組織（P<0.05）。②REGγ在乳腺癌組織的表達(dá)在T≤2cm組中明顯低于T>2cm組（P<0.05）。⑧REGγ在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的乳腺癌中表達(dá)明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的乳腺癌（P<0.05）。④乳腺癌c-erBb-2（+）組的表達(dá)高于c-erBb-2（-）組（P<0.05）。⑤ER（-）組的REGγ表達(dá)明顯高于ER（

4、+）組的（P<0.05）。⑥在乳腺癌中，組織學(xué)Ⅲ級(jí)組的REGγ表達(dá)與Ⅰ和Ⅱ級(jí)組的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論: REGγ在乳腺癌組織中表達(dá)明顯增強(qiáng)。REGγ的表達(dá)在T>2cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、c-erBb-2（+）及ER（-）乳腺癌組織中表達(dá)增高，與腫瘤分級(jí)無(wú)關(guān)。 目的:在人乳腺癌細(xì)胞中構(gòu)建及鑒定REGγ蛋白shRNA表達(dá)載體。 方法:按照Elbashir等及Reynolds的設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)并合成針對(duì)RE

5、Gγ蛋白編碼基因REGγ的shRNA，并克隆入轉(zhuǎn)錄載體pGenesil-1，構(gòu)建重組質(zhì)粒pshRNAREGγ-1，pshRNAREGγ-2和pshRNAREGγ-HK（陰性對(duì)照質(zhì)粒）；大量提取重組質(zhì)粒，采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7，并用G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，應(yīng)用real-time-quantitative RT-PCR和Western Blot法分別在mRNA和蛋白水平

6、檢測(cè)REGγ基因的干擾效果。 結(jié)果:成功構(gòu)建三個(gè)重組質(zhì)粒，分別為pshRNAREGγ-1，pshRNAREGγ-2和陰性對(duì)照質(zhì)粒pshRNAREGγ-HK。Real-time quantitative RT-PCR檢測(cè)顯示REGγ基因在mRNA轉(zhuǎn)錄水平被顯著抑制，pshRNAREGγ-1，pshRNAREGγ-2在兩株細(xì)胞中分別抑制到未轉(zhuǎn)染細(xì)胞細(xì)胞的36％，48％和38％，46％。Western Blot檢測(cè)結(jié)果與realtim

7、e-RT-PCR相似，pshRNAREGγ-1，pshRNAREGγ-2在兩株細(xì)胞中分別將REGγ蛋白抑制到未轉(zhuǎn)染細(xì)胞細(xì)胞的38.23％，45.12％和36.43％，48.46％。pshRNAREGγ-2干擾效果較好。 結(jié)論:重組質(zhì)粒pshRNAREGγ-1，pshRNAREGγ-2均能有效抑制人乳腺癌細(xì)胞REGγ蛋白的表達(dá)，以pshRNAREGγ-2干擾效果最好。第四部分REGγ蛋白shRNA作用乳腺癌細(xì)胞株后其相關(guān)蛋白的變

8、化及意義 目的:研究REGγ蛋白shRNA作用于不同人乳腺癌細(xì)胞后其相關(guān)基因在mRNA和蛋白水平的變化以及對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期及凋亡等的影響。 方法:采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染pshRNAREGγ-2質(zhì)粒到人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7中，并用G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。采用Western blotting、real-time quantitative PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后不

9、同乳腺癌細(xì)胞后相關(guān)蛋白SRC-3、PCNA和p21在蛋白水平和mRNA水平的變化；電鏡和Tunel法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡的改變；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化；MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的變化。 結(jié)果: pshRNAREGγ-2轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞后，real-time-quantitative RT-PCR結(jié)果顯示兩株細(xì)胞的REGγ的mRNA水平均下降，但SRC-3、PCNA和p21的mRNA水平無(wú)明顯變化；Western blot和免

10、疫細(xì)胞化學(xué)則顯示REGγ蛋白水平明顯下降，PCNA表達(dá)下降，SRC-3有不同程度增加（P<0.05），在MDA-MB-231細(xì)胞中p21蛋白水平有明顯增加（P<0.05），但在MCF-7細(xì)胞中無(wú)明顯改變（P>0.05）。電鏡和TUNEL結(jié)果顯示MDA-MB-231凋亡小體明顯增多，但MCF-7的凋亡小體無(wú)明顯變化。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期顯示，在MDA-MB-231細(xì)胞中，S期細(xì)胞比例明顯減少，G1期細(xì)胞比例明顯增加（P<0.05）；而在