WT1在乳腺癌進展中的作用及機制研究.pdf

1、乳腺癌是女性最常見和死亡率最高的惡性腫瘤。侵襲轉移是惡性腫瘤重要的生物學特征，也是導致乳腺癌患者死亡的主要原因，但具體過程和機理至今尚不明確。因此，進一步研究乳腺癌侵襲轉移機制并探索有效的防控措施，對提高患者的生存率和生存質量具有重要意義。惡性腫瘤的發(fā)生和侵襲轉移過程受多層次、多因素調控，癌基因與抑癌基因作用的失衡是其中的關鍵環(huán)節(jié)之一。因此，尋找新的或進一步揭示已有癌基因或抑癌基因的功能，對闡明惡性腫瘤發(fā)生和演進機理、研發(fā)潛在治療靶點具

2、有重要意義。
　　 Wilms瘤基因1(Wilms'tumor gene 1，WT1)首先在腎母細胞瘤(又稱Wilms瘤)中作為抑癌基因被克隆鑒定，定位于11p13。WT1編碼產物是一種具有轉錄激活和抑制雙重功能的鋅指轉錄因子。在發(fā)育過程中，WT1通過調控多種靶基因和信號通路參與心臟、腎臟和脾臟等器官的形成。研究表明WT1在成體組織中的異常表達與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關，但根據細胞特征不同，其可發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用。一方面

3、，在Wilms瘤等兒童惡性腫瘤中，WT1通過干擾細胞增殖信號等途徑抑制細胞生長，發(fā)揮抑癌基因作用；另一方面，WT1可增強腫瘤細胞得抗凋亡能力，并通過調控原癌基因K-ras促進細胞增殖，提示WT1也能發(fā)揮癌基因作用。
　　 根據目前關于WT1與乳腺癌的臨床研究結果，多數(shù)學者傾向于認為WT1在乳腺癌中發(fā)揮癌基因作用，但該結論并未得到所有研究團隊的證實、仍存一定爭議。系統(tǒng)回顧WT1在乳腺癌領域的研究成果，我們發(fā)現(xiàn)：WT1的表達情況與乳

4、腺癌患者臨床病理特征及預后的關系至今尚無明確結論，尤其是其在乳腺癌不同分子亞型中的表達是否存在差異未見文獻報道。同時，WT1在乳腺癌進展中的具體作用和機制至今尚不清楚，其促進還是抑制細胞增殖尚存爭議，而其是否參與乳腺癌的侵襲轉移過程、具體作用及分子機制如何，未見文獻報道。此外，雖然已知WT1可調控下游多種生長因子發(fā)揮生物學作用，但對其上游調控機制的研究和認識甚少。
　　 針對上述問題，本研究通過生物信息學方法挖掘、分析已公布的基

5、因芯片數(shù)據，闡明WT1 mRNA與乳腺癌分子亞型及患者預后的關系；通過免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)的方法檢測乳腺癌組織WT1蛋白表達情況，并分析其與患者臨床病理特征的關系。采用RNA干擾(RNA interfering，RNAi)技術下調WT1表達，采用RNA激活(RNA activating，RNAa)技術上調WT1表達，借此分析WT1在乳腺癌細胞增殖、凋亡、周期、侵襲及遷移中的作用，并以細胞增殖及

6、轉移關鍵分子-抑制分化抑制因子1(inhibitor of differentiation1)為切入點初步探討WT1發(fā)揮生物學功能的分子機制。同時，通過建立轉化生長因子β1(transforming growth factorβ1，TGF-β1)誘導的上皮間質轉化(epithelial-mesenchyrmal transition，EMT)細胞模型，探索TGF-β1對WT1的調控作用及效應；通過對TGF-β1單核甘酸多態(tài)性(singl

7、e nucleotide polymorphisms，SNPs)與乳腺癌發(fā)病風險的關系進行meta分析，進一步揭示其與乳腺癌發(fā)生的關系。通過上述研究以期初步探討WT1在乳腺癌進展中的作用及分子機制，為進一步揭示WT1在惡性腫瘤中生物學行為提供實驗依據，為惡性腫瘤的分子靶點的研發(fā)提供新的思路。
　　 實驗方法和主要結果：
　　 1.WT1與乳腺癌原發(fā)腫瘤特征及預后的關系
　　 方法：利用生物信息學的方法挖掘包含26

8、6例乳腺癌患者的GSE21653基因芯片數(shù)據，分析WT1 mRNA表達水平與乳腺癌分子亞型及預后的關系；免疫組織化學法檢測46例乳腺癌組織WT1蛋白表達情況，分析其與患者臨床病理特征的關系。
　　 結果：在GSE21653中，WT1 mRNA在組織學分級高(G2 VS.G1，P=0.0260；G3 VS。G1，P=8.04e-5)、ER陰性(ER陰性VS.ER陽性，P=0.0500)、Basal-like型及ERBB2/HER-

9、2過表達型(Basal-like型vs.Luminal A型，P=0.0049；Basal-like型vs.Luminal型，P=0.0350；ERBB2/HER-2過表達型vs.Luminal型，P=0.0350)的乳腺癌患者中表達水平明顯升高。單變量分析顯示WT1 mRNA高表達患者的無病生存率顯著低于低表達患者(風險比[HR]=3.294，95％可信區(qū)間[CI]=1.198-9.055，P=0.014)，多變量分析顯示WT1是乳腺

10、癌患者的獨立預后不良因素(HR=3.4539，95％CI=1.2029-9.918，P=0.0213；WT1 mRNA高表達患者vs.WT1 mRNA低表達患者)。在46例乳腺癌患者中，WT1蛋白陽性表達率為84.8％(39/46)。WT1表達與患者年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、淋巴結分期、TNM分期、ER、PR、HER-2狀態(tài)及分子亞型均無明顯關系(P>0.05)。
　　 2.WT1在乳腺癌中的生物學作用及下游信號分子機制初步探討

11、
　　 方法：qRT-PCR、Western blotting(WB)和免疫細胞化學法檢測WT1在人乳腺癌MCF-7、Bcap-37、SKBR-3及MDA-MB-321細胞中的表達情況，篩選WT1高表達和低表達細胞。以國外學者提供的三條序列為靶點構建WT1小干擾RNA(siRNA)以沉默表達WT1，以文獻公布的、已證實可上調表達WT1的序列構建雙鏈RNA(dsRNA)以過表達WT1，通過脂質體法分別轉染MDA-MB-321和MC

12、F-7細胞，通過qRT-PCR和WB篩選作用效果最明顯的siRNA和dsRNA。利用CCK8、Annexin V/PI及transwell法觀測干擾WT1表達后對乳腺癌細胞增殖、凋亡、周期、侵襲及遷移能力的影響。同時通過qRT-PCR和WB檢測干擾WT1后對細胞Id1蛋白表達水平的影響。
　　 結果：WT1在MDA-MB-321中的表達水平明顯高于其在MCF-7、Bcap-37和SKBR-3中的表達水平，確定以MDA-MB-23

13、1作為RNAi細胞模型、以MCF-7作為RNAa細胞模型。成功構建三個WT1 siRNA并轉染到MDA-MB-231細胞中，均能夠有效抑制WT1 mRNA和蛋白的表達，以轉染48h時WT1 siRNA-1029的效果最為顯著。使用WT1 siRNA-1029轉染MDA-MB-231細胞、干擾其WT1表達后，細胞的增殖能力下降，同時早期、晚期凋亡細胞和G1期細胞比例增加，S期和G2期細胞比例降低，細胞的侵襲及遷移能力降低；干擾WT1可下調

14、Id1蛋白的表達水平并使細胞的侵襲遷移能力下降。成功將WT1 dsRNA-319轉染到MCF-7細胞中，在50μ mol/L、轉染96h時WT1 dsRNA-319對MCF-7細胞WT1的過表達作用最為顯著，且這一過程伴隨MCF-7細胞增殖、侵襲及遷移能力的增高。
　　 3.TGF-β1調控WT1表達的效應觀察研究及TGF-β1單核甘酸多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病風險關系的meta分析
　　 方法：使用TGF-β1(濃度：10ng

15、/ml，作用時間：48h)誘導MCF-7細胞，觀察細胞形態(tài)變化、WT1 mRNA、蛋白水平改變情況以及細胞侵襲遷移能力變化。利用計算機檢索截止2010年3月MEDLINE、PubMed、Web of Science、EMBASE、CNKI、萬方、VIP和中國生物醫(yī)學服務系統(tǒng)(SinoMed)等數(shù)據庫中有關TGF-β1 T869C和C-509T多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病風險關系的研究，根據納入標準提取有效數(shù)據后，采用STATA軟件進行meta分析

16、。
　　 結果：加入TGF-β1可使乳腺癌MCF-7細胞由上皮細胞樣形態(tài)轉變?yōu)殚g質細胞樣形態(tài)，這一過程伴隨WT1 mRNA和蛋白表達水平的顯著升高，同時還可使MCF-7細胞的侵襲及遷移能力明顯增高。Meta分析結果顯示，TGF-β1基因T869C多態(tài)性的C等位基因與總體人群乳腺癌發(fā)病風險無關(C vs.T：OR=1.033，95％CI=0.996-1.072)，但亞群分析顯示其與高加索人乳腺癌發(fā)病風險增高有關(C vs.T：OR

17、=1.051，95％CI=1.018-1.085；CC vs.TT+TC：OR=1.083，95％CI=1.019-1.151)；TGF-β1基因C-509T多態(tài)性的T等位基因與總體人群乳腺癌發(fā)病風險無關(T vs.C：OR=0.986.95％CI=0.936-1.039)。
　　 結論：
　　 1、WT1在乳腺癌中發(fā)揮癌基因樣功能，可增強乳腺癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力，導致乳腺癌惡性程度增加。依據有：
　　

18、①WT1在組織學分級高、ER陰性的Basal-like型、HER-2過表達型的乳腺癌中表達水平顯著增高，WT1高表達可能是乳腺癌患者的獨立預后不良因素；
　　 ②干擾WT1表達可使MDA-MB-231細胞的增殖、侵襲及遷移能力降低，而過表達WT1可使MCF-7細胞的增殖、侵襲及遷移能力升高。
　　 2、TGF-β1可能是WT1的上游調控分子，而Id1可能是WT1的下游靶分子。依據有：
　　 ①TGF-β1可上調M