miR-124在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、[研究背景及目的]
　　乳腺癌是我國(guó)女性中最常見的惡性腫瘤。盡管隨著診斷和治療水平的發(fā)展，早期乳腺癌更容易得到診斷，并已有標(biāo)準(zhǔn)的治療選擇，生存率也有所提高。然而，晚期乳腺癌患者常發(fā)生局部進(jìn)展或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，目前仍無公認(rèn)的治療標(biāo)準(zhǔn)，生存期亦未得到顯著改善。乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移最常見的部位是骨。骨轉(zhuǎn)移可引起骨痛、病理性骨折、脊髓壓迫等骨相關(guān)事件(SREs)，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和總體預(yù)后。
　　目前，除了化療、內(nèi)分泌治療和分子靶向治療等

2、全身治療以及手術(shù)治療和放療等局部治療以外，骨調(diào)節(jié)藥物(bone modifying agents)因可發(fā)揮預(yù)防和治療骨轉(zhuǎn)移相關(guān)事件的作用，已在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者的治療中占據(jù)重要地位。然而，骨調(diào)節(jié)藥物并不能預(yù)防乳腺癌患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，亦沒有證據(jù)證實(shí)其可延長(zhǎng)患者生存時(shí)間。因此，深入研究發(fā)生乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)，將有助于進(jìn)一步改善患者的生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期。
　　乳腺癌骨轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞經(jīng)過遷移、侵襲、粘附等環(huán)節(jié)到達(dá)骨微

3、環(huán)境后，和骨微環(huán)境中的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨基質(zhì)細(xì)胞之間產(chǎn)生復(fù)雜的相互作用，導(dǎo)致成骨/破骨平衡打破，形成了主要表現(xiàn)為溶骨性病變的病灶，引發(fā)骨相關(guān)事件。在以上過程中，許多發(fā)揮調(diào)控作用的基因或分子表達(dá)出現(xiàn)異常，可能成為新的作用靶點(diǎn)或診斷標(biāo)志物，微小RNA（microRNA，miRNA）就是其中的研究熱點(diǎn)之一。作為基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要元件之一，miRNA可通過作用于與乳腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或骨微環(huán)境中的重要細(xì)胞因子或趨化因子促進(jìn)或抑

4、制乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生。作為內(nèi)源存在的非編碼雙鏈RNA，miRNA具有一定的組織特異性和分子靶向性，通過外源性調(diào)控相關(guān)miRNA表達(dá)可能比傳統(tǒng)的放化療更安全，可能成為治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的新手段，具有良好的應(yīng)用前景。
　　miR-124最早在小鼠腦組織中被克隆，隨后被證實(shí)在人胚胎干細(xì)胞中亦有表達(dá)。作為腦組織中表達(dá)量最高的miRNA之一，已有許多研究表明miR-124主要參與了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，其表達(dá)異常與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)。近來有越來越

5、多的研究關(guān)注miR-124在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。有研究表明miR-124在乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、白血病等多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，并通過靶向作用于多個(gè)癌基因發(fā)揮抑制腫瘤惡性生物學(xué)行為的作用。其中有數(shù)個(gè)研究證實(shí)miR-124可抑制乳腺癌的增殖、遷移和侵襲，提示其在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。但目前為止，關(guān)于miR-124在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中的作用尚未見報(bào)道。因此，本課題旨在明確miR-124在

6、乳腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生中的作用，并初步探討其作用機(jī)制，為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的治療提供新的靶點(diǎn)。
　　[實(shí)驗(yàn)方法]
　　一、miR-124在不同骨轉(zhuǎn)移能力乳腺癌細(xì)胞及小鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)
　　1、比較正常乳腺組織和不同轉(zhuǎn)移能力乳腺癌細(xì)胞中miR-124表達(dá)：分離正常小鼠乳腺組織，抽取RNA。培養(yǎng)不同骨轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細(xì)胞株BT549、 MDA-MB-231、Hs578t、MDA-MB-468、MDA-MB-436、MCF7、

7、T47D、BT474,抽取細(xì)胞總RNA。Real-time PCR法檢測(cè)以上組織和細(xì)胞中miR-124的表達(dá)情況。
　　2、檢測(cè)并比較母代乳腺癌細(xì)胞和小鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中miR-124表達(dá)：小鼠左心室注射熒光素酶標(biāo)記的MDA-MB-231制備乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型?；铙w成像儀監(jiān)測(cè)小鼠在體熒光信號(hào)。待發(fā)生骨轉(zhuǎn)移后處死小鼠，留取骨轉(zhuǎn)移組織，抽取RNA。Real-time PCR法檢測(cè)以上組織和母代MDA-MB-231細(xì)胞中miR-124的

8、表達(dá)情況。
　　3、檢測(cè)人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中miR-124表達(dá)，分析其與患者無轉(zhuǎn)移生存期關(guān)系
　　收集5例乳腺癌患者原發(fā)癌組織、癌旁組織和骨轉(zhuǎn)移組織標(biāo)本，原位雜交法檢測(cè)miR-124表達(dá)，比較各組表達(dá)差異。收集20例人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本，抽取總RNA，Real-time PCR法檢測(cè)miR-124的表達(dá)情況。通過隨訪了解患者從發(fā)現(xiàn)原發(fā)癌到發(fā)現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移灶的時(shí)間，即無骨轉(zhuǎn)移生存期（Bone metastasis free survi

9、val），分析miR-124表達(dá)與患者無骨轉(zhuǎn)移生存期的相關(guān)性。
　　二、體外調(diào)控乳腺癌細(xì)胞miR-124表達(dá)對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的作用
　　1、上調(diào)乳腺癌細(xì)胞miR-124表達(dá)或抑制其作用對(duì)骨髓來源的巨噬細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的影響：乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的miR-124擬似物(miR-124mimic)及陰性對(duì)照（NC）或miR-124競(jìng)爭(zhēng)性抑制物(miR-124 inhibitor)及陰性對(duì)照（inhib

10、itor NC），收取轉(zhuǎn)染后48小時(shí)培養(yǎng)上清。從小鼠股骨分離骨髓來源巨噬細(xì)胞（BMM）作為破骨細(xì)胞前體細(xì)胞，利用上述各組腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清培養(yǎng)BMM細(xì)胞，6天后進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色明確破骨細(xì)胞分化情況。
　　2、改變?nèi)橄侔┘?xì)胞miR-124表達(dá)對(duì)成骨細(xì)胞RANKL和OPG表達(dá)影響：MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-124 mimic及NC或miR-124 inhibitor及inhibitorNC，轉(zhuǎn)染后48小

11、時(shí)收取上清。利用各組上清分別培養(yǎng)成骨細(xì)胞前體細(xì)胞株3T3E1細(xì)胞，6天后提取不同上清培養(yǎng)組3T3E1細(xì)胞的RNA，Real-time PCR法檢測(cè)其中RANKL和OPG表達(dá)。
　　3、上調(diào)乳腺癌細(xì)胞miR-124表達(dá)對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞相互作用的影響：MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-124 mimic及NC。上述各組乳腺癌細(xì)胞分別和3T3E1細(xì)胞共培養(yǎng)，3天后收集各組培養(yǎng)上清，利用該上清培養(yǎng)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞株RAW264.7，

12、培養(yǎng)3天后提取各組細(xì)胞的RNA，Real-time PCR法檢測(cè)其中與破骨細(xì)胞分化相關(guān)的指標(biāo)TRAP、c-Src、NFATc1和c-fos表達(dá)。
　　三、初步探討miR-124在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制
　　1、利用軟件預(yù)測(cè)并篩選miR-124與骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因：利用TargetScan軟件預(yù)測(cè)miR-124靶基因，并篩選其中與骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)白介素11（Interleukin11，IL11）為其潛在靶基因。

13、　　2、明確miR-124對(duì)IL11表達(dá)的影響：MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-124 mimic或inhibitor，Real-time PCR法檢測(cè)IL11mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)其蛋白表達(dá)。
　　3、驗(yàn)證miR-124與IL113'端非翻譯區(qū)(3'-untranslated region，3'-UTR)的靶向結(jié)合作用：構(gòu)建含有miR-124結(jié)合位點(diǎn)的IL113'-UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒及該位點(diǎn)突變的

14、報(bào)告基因質(zhì)粒，與miR-124 mimic或NC共轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞，雙報(bào)告基因試劑盒檢測(cè)報(bào)告基因質(zhì)粒熒光素酶活性，明確miR-124是否可通過結(jié)合IL113'-UTR靶向調(diào)控IL11的表達(dá)。
　　4、驗(yàn)證IL11和miR-124在乳腺癌細(xì)胞及乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)的相關(guān)性
　　(1)正常乳腺組織和不同轉(zhuǎn)移能力乳腺癌細(xì)胞中IL11和miR-124表達(dá)相關(guān)性：Real-time PCR法檢測(cè)正常小鼠乳腺組織和乳腺癌細(xì)胞株

15、BT549、MDA-MB-231、Hs578t、MDA-MB-468、MDA-MB-436、MCF7、T47D、BT474中IL11的表達(dá)情況，分析其與miR-124表達(dá)是否存在負(fù)相關(guān)。
　　(2)母代乳腺癌細(xì)胞和小鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中IL11和miR-124表達(dá)相關(guān)性：Real-time PCR法檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移模型小鼠標(biāo)本和母代MDA-MB-231細(xì)胞中IL11的表達(dá)情況，分析其與miR-124表達(dá)的相關(guān)性。

16、
　　(3)人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中IL11和miR-124表達(dá)相關(guān)性：收集5例乳腺癌患者原發(fā)癌組織、癌旁組織和骨轉(zhuǎn)移組織標(biāo)本，免疫組化法檢測(cè)IL11表達(dá)，分析其與miR-124表達(dá)相關(guān)性。收集20例人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本，抽取總RNA，Real-time PCR法檢測(cè)IL11的表達(dá)情況，分析其與miR-124表達(dá)的相關(guān)性。
　　四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　若無特殊說明，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行生物學(xué)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。數(shù)據(jù)以(X)±SD，即均數(shù)

17、±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。方差齊性的兩組之間比較采用student t檢驗(yàn)(Student's t test)，方差非齊性則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。通過統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)計(jì)算P值，P＜0.05為具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]
　　一、miR-124在高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞及小鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)下調(diào)
　　1、miR-124在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，且在骨轉(zhuǎn)移能

18、力較高的乳腺癌細(xì)胞株中表達(dá)較低：Real-time PCR結(jié)果顯示，與正常小鼠乳腺組織相比，乳腺癌細(xì)胞中miR-124表達(dá)顯著下調(diào)，且其在骨轉(zhuǎn)移性較高的三陰（雌激素受體、孕激素受體和HER2均為陰性）乳腺癌細(xì)胞株BT549、MDA-MB-231、Hs578t、MDA-MB-468、MDA-MB-436中表達(dá)較骨轉(zhuǎn)移性低的細(xì)胞株MCF7、T47D、BT474低。
　　2、小鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中miR-124表達(dá)下調(diào)：小鼠左心室注射M

19、DA-MB-231細(xì)胞制備乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型。Real-time PCR結(jié)果顯示，與母代MDA-MB-231細(xì)胞相比，小鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中的miR-124表達(dá)量顯著下調(diào)。
　　3、人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中miR-124表達(dá)下調(diào)，且其表達(dá)與患者無骨轉(zhuǎn)移生存期相關(guān)：原位雜交法檢測(cè)乳腺癌患者原發(fā)癌組織、癌旁組織和骨轉(zhuǎn)移組織標(biāo)本miR-124表達(dá)，結(jié)果顯示與原發(fā)癌旁組織相比，人乳腺癌組織中miR-124表達(dá)明顯減少，在骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本中表達(dá)進(jìn)一步減

20、少。檢測(cè)20例人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本中miR-124表達(dá)并隨訪患者臨床過程后發(fā)現(xiàn)miR-124表達(dá)低者無骨轉(zhuǎn)移生存期較miR-124表達(dá)高者短。
　　二、體外調(diào)控乳腺癌細(xì)胞miR-124表達(dá)可直接或通過成骨細(xì)胞促進(jìn)破骨細(xì)胞分化
　　1、上調(diào)乳腺癌細(xì)胞miR-124表達(dá)抑制BMM細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞，抑制miR-124作用促進(jìn)BMM細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞：MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-124 mimic或NC后收集上清培養(yǎng)BMM細(xì)

21、胞，TRAP染色結(jié)果顯示miR-124 mimic組破骨細(xì)胞分化較對(duì)照組顯著減少。反之，MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-124 inhibitor或inhibitor NC后收集上清培養(yǎng)BMM細(xì)胞，TRAP染色結(jié)果顯示miR-124 inhibitor組破骨細(xì)胞分化較對(duì)照組顯著增加。
　　2、上調(diào)乳腺癌細(xì)胞miR-124表達(dá)增加成骨細(xì)胞OPG/RANKL比值，抑制miR-124作用降低成骨細(xì)胞OPG/RANKL比值：MDA-M

22、B-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-124 mimic或NC后收集上清培養(yǎng)3T3E1細(xì)胞，Real-time PCR結(jié)果顯示miR-124 mimic上清組3T3E1細(xì)胞中OPG與RANKL比值增加。反之，MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-124 inhibitor或inhibitor NC后收集上清培養(yǎng)3T3E1細(xì)胞，Real-time PCR結(jié)果顯示miR-124 inhibitor上清組3T3E1細(xì)胞中OPG與RANKL比值降低。

23、　　3、上調(diào)乳腺癌細(xì)胞miR-124表達(dá)抑制成骨細(xì)胞促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的能力：MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-124mimic或NC后分別和3T3E1細(xì)胞共培養(yǎng)，收上清培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，Real-time PCR結(jié)果顯示miR-124mimic組上清培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞中與破骨細(xì)胞分化相關(guān)的指標(biāo)TRAP、c-Src、NFATc1和c-fos表達(dá)顯著下調(diào)。
　　三、miR-124部分通過調(diào)控IL11抑制乳腺癌骨轉(zhuǎn)移<

24、br>　　1、miR-124抑制IL11 mRNA和蛋白表達(dá)：MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-124 mimic或inhibitor，Real-time PCR結(jié)果顯示miR-124 mimic抑制IL11 mRNA表達(dá)，miR-124 inhibitor增加IL11 mRNA表達(dá);Westem blot結(jié)果顯示miR-124 mimic抑制IL11蛋白表達(dá)，miR-124 inhibitor促進(jìn)IL11蛋白表達(dá)。
　　2、m

25、iR-124靶向結(jié)合IL113'-UTR：構(gòu)建IL113'-UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，與miR-124mimic或NC共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞，雙報(bào)告基因試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示miR-124 mimic可抑制該報(bào)告基因活性;將IL113'-UTR上miR-124結(jié)合位點(diǎn)突變，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，雙報(bào)告基因試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示位點(diǎn)突變后，miR-124 mimic對(duì)報(bào)告基因的作用消失。以上結(jié)果提示miR-124可通過結(jié)合IL113'-UTR靶向調(diào)控IL1

26、1的表達(dá)。
　　3、IL11和miR-124在乳腺癌細(xì)胞及乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)
　　(1)正常乳腺組織和不同轉(zhuǎn)移能力乳腺癌細(xì)胞中IL11和miR-124表達(dá)呈負(fù)相關(guān)
　　Real-time PCR法檢測(cè)正常小鼠乳腺組織和乳腺癌細(xì)胞株BT549、MDA-MB-231、Hs578t、MDA-MB-468、MDA-MB-436、MCF7、T47D、BT474中IL11的表達(dá)情況，相關(guān)性分析結(jié)果顯示IL11與mi

27、R-124表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。
　　(2)小鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中IL11和miR-124表達(dá)呈負(fù)相關(guān)
　　Real-time PCR法檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移模型小鼠標(biāo)本和母代MDA-MB-231細(xì)胞中中IL11的表達(dá)情況，相關(guān)性分析結(jié)果顯示IL11與miR-124表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。
　　(3)人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中IL11和miR-124表達(dá)相關(guān)性
　　免疫組化法檢測(cè)乳腺癌患者原發(fā)癌組織、癌旁組織和骨轉(zhuǎn)移

28、組織標(biāo)本IL11表達(dá)，結(jié)果顯示與原發(fā)癌旁組織相比，人乳腺癌組織中IL11表達(dá)明顯增加，在骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本中表達(dá)進(jìn)一步增加。收集20例人乳腺癌骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本， Real-time PCR及相關(guān)性分析結(jié)果顯示其中IL11的表達(dá)與miR-124表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。
　　[結(jié)論]
　　一、miR-124乳腺癌細(xì)胞和乳腺癌骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本中表達(dá)下調(diào)，并與患者無轉(zhuǎn)移生存期密切相關(guān)，提示其在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。
　　二、乳腺癌細(xì)胞中miR