腫瘤細(xì)胞骨保護(hù)素表達(dá)調(diào)控乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的作用和機(jī)制研究.pdf

1、乳腺癌最容易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移到骨，其骨轉(zhuǎn)移的機(jī)理迄今為止仍未完全闡明，這也使得針對骨轉(zhuǎn)移的各種治療方法效果均不夠滿意。因此進(jìn)一步闡明乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療具有重要意義。雖然已知骨組織中的骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)表達(dá)下降是乳腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素和腫瘤細(xì)胞自身OPG表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，且重組人OPG已進(jìn)入治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的臨床實(shí)驗(yàn)，但腫瘤細(xì)胞自身OPG表達(dá)在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展中

2、的作用和機(jī)制目前仍不清楚，這也制約了針對OPG的乳腺癌骨轉(zhuǎn)移治療方法的發(fā)展。為此，我們以乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231和裸鼠骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型為研究對象，試圖探討腫瘤細(xì)胞自身OPG表達(dá)在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制。本研究分為以下幾個(gè)部分： 1.乳腺癌骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的構(gòu)建 目的：建立乳腺癌骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型。 方法：40只4周～6周齡雌性裸鼠隨機(jī)分為5組，每組8只，用濃度分別為1×105/ml，1×106/ml，

3、5×106/ml，1×107/ml，5×107/ml的MDA-MB-231細(xì)胞懸液0.1ml行左心室注射。觀察裸鼠左心室注射致死情況及存活裸鼠49天后骨轉(zhuǎn)移發(fā)生情況。 結(jié)果：左心室穿刺注射總致死率為32.50％(13/40)；各組左心室穿刺注射致死率分別為1/8，1/8，1/8，3/8，7/8，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)。全組骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率為48.15％(13/27)；各組骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率分別為：0/7，3/7，5/7

4、，4/5，1/1，各組骨轉(zhuǎn)移發(fā)生情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.014)。 結(jié)論：經(jīng)裸鼠左心室穿刺注射腫瘤細(xì)胞成功建立了乳腺癌骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型；經(jīng)裸鼠左心室注射建立乳腺癌骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的腫瘤細(xì)胞適宜濃度為5×106/ml。 2.建立乳腺癌骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型方法的比較研究 目的：對四種乳腺癌骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的構(gòu)建方法進(jìn)行比較研究。 方法：32只4～6周齡雌性裸鼠隨機(jī)分為A、B、C、D4組，每組8只，每只裸鼠以5×10

5、5個(gè)MDA-MB-231細(xì)胞按分組分別注射入左第二乳房脂肪墊、尾靜脈、左心室和左脛骨骨髓腔。觀察A組裸鼠乳腺原位成瘤情況、全組注射致死情況和全組49天后骨轉(zhuǎn)移發(fā)生情況。 結(jié)果：A組乳腺原位移植瘤形成率為87.5％(7/8)。僅C組注射致死裸鼠1只。各組骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率分別為：0(0/8)，12.5％(1/8)，71.4％(5/7)，100％(8/8)。A組和C組、A組和D組、B組和C組、B組和D組之間骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

6、 結(jié)論：腫瘤細(xì)胞經(jīng)乳腺原位移植和尾靜脈注射移植兩種方法不適于建立乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型；腫瘤細(xì)胞經(jīng)左心室注射移植和骨原位移植方法能穩(wěn)定地獲得骨轉(zhuǎn)移，是乳腺癌骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型構(gòu)建的可行方法。 3.RNA干擾對MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞株骨保護(hù)素基因表達(dá)的抑制作用 目的：構(gòu)建針對骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)基因的一個(gè)載體編碼三條shRNA的真核表達(dá)質(zhì)粒，觀察其對MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞株OPG

7、表達(dá)的抑制作用。 方法：選擇3個(gè)針對OPG基因的RNAi位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)合成3對編碼相應(yīng)shRNA的DNA單鏈，每對單鏈連接形成雙鏈后分別與線性化載體pGenesil-1.1、pGenesil-1.2、pGenesil-1.3連接形成pGenesil-1.1-shRNAI、pGenesil-1.2-shRNA2、pGenesil-1.3-sbRNA2，對以上重組載體反復(fù)酶切連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pGenesil-1.1-1.2-1.

8、3-shRNAl-shRNA2-shRNA3，酶切鑒定和測序無誤后，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，以G418加壓篩選，對轉(zhuǎn)染細(xì)胞行單克隆化，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞行RT-PCR和Western blot檢測，確定其對OPG基因表達(dá)抑制作用。 結(jié)果：成功構(gòu)建了pGenesil-1.1-1.2-1.3-shRNAl-shRNA2-shRNA3重組質(zhì)粒；以該質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后其OPG mRNA和蛋白表達(dá)均較對照差異具

9、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，RNAi對OPG mRNA和蛋白的表達(dá)抑制率分別為91％和73％。 結(jié)論：本研究構(gòu)建了針對OPG的一個(gè)載體編碼三條shRNA的真核表達(dá)質(zhì)粒，通過RNAi抑制了MDA-MB-231細(xì)胞OPG基因表達(dá)，為進(jìn)一步深入探討腫瘤細(xì)胞自身OPG表達(dá)在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展中的作用提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 4.抑制骨保護(hù)素表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖及TRAIL致其凋亡的影響 目的：觀察抑制腫瘤細(xì)胞OPG表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞株MDA

10、-MB-231增殖和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand.TRAIL)致其凋亡的影響。 方法：采用MTT法檢測對照MDA-MB-231和MDA-MB-231i細(xì)胞(OPG表達(dá)抑制)增殖；流式細(xì)胞術(shù)分析對照MDA-MB-231細(xì)胞和TRAIL作用24h后MDA-MB-231、MDA-MB-231i細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果：前兩

11、組細(xì)胞倍增時(shí)間分別為43.5±2.9和45.8±3.6小時(shí)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；后三組細(xì)胞凋亡率分別為6.4±1.3％、16.1±1.7％和24.4±3.3％，每兩組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：抑制乳腺癌細(xì)胞OPG表達(dá)不影響其增殖能力。TRAIL可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，抑制乳腺癌細(xì)胞OPG表達(dá)顯著增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)其凋亡能力。 5.抑制腫瘤細(xì)胞骨保護(hù)素表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞致骨轉(zhuǎn)移能力的影響 目的：觀察抑制腫瘤細(xì)胞骨

12、保護(hù)素表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231致骨轉(zhuǎn)移的影響。 方法：32只4～6周齡雌性裸鼠隨機(jī)分為A、B、C、D4組，每組8只，A、C組每只裸鼠按分組分別以5×105個(gè)MDA-MB-231細(xì)胞注射入左心室和左脛骨骨髓腔。B、D組每只裸鼠按分組分別以5×105個(gè)MDA-MB-231i細(xì)胞(OPG表達(dá)抑制)注射入左心室和左脛骨骨髓腔，42天后行病理檢查，比較A、B組骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率和骨轉(zhuǎn)移灶數(shù)量，比較C、D組骨腫瘤體積。 結(jié)果

13、：A組骨轉(zhuǎn)移灶數(shù)量多于B組，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A組骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率雖高于B組，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C組骨腫瘤體積大于D組，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：乳腺癌細(xì)胞致骨轉(zhuǎn)移能力與其OPG表達(dá)水平密切相關(guān)，抑制OPG表達(dá)可以降低乳腺癌細(xì)胞致骨轉(zhuǎn)移能力。低表達(dá)OPG的乳腺癌細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移能力下降的原因?yàn)椋阂种迫橄侔┘?xì)胞OPG表達(dá)使得癌細(xì)胞自身表達(dá)的OPG對其保護(hù)作用減弱，骨組織表達(dá)的TRAIL對其誘導(dǎo)凋亡作用增強(qiáng)，促使癌細(xì)胞凋亡，