Lin28在乳腺癌化療耐受中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、1.實(shí)驗(yàn)背景和目的：
　　化療耐藥是目前腫瘤治療中所面臨的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。目前，在腫瘤耐藥機(jī)制研究中最熱門的研究之一是腫瘤干細(xì)胞與化療耐藥相關(guān)性的研究。近些年來(lái)諸多證據(jù)表明許多惡性腫瘤的耐藥性與其腫瘤干細(xì)胞密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞相關(guān)基因lin28與惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、預(yù)后以及誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞形成等密切相關(guān)。另外，我們的前期研究提示lin28在多種惡性腫瘤耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)較其母代細(xì)胞株表達(dá)水平明顯升高。由此，我們推測(cè)作為干細(xì)胞相

2、關(guān)基因lin28可能與腫瘤化療耐藥相關(guān).到目前為止，尚未見有關(guān)lin28與腫瘤化療耐藥相關(guān)性研究的報(bào)道。本研究目的旨在探討干細(xì)胞相關(guān)基因lin28與乳腺癌細(xì)胞紫杉醇(paelitaxel，PAC)耐藥的相關(guān)性，并進(jìn)一步研究其可能的內(nèi)在機(jī)制，為克服乳腺癌化療耐藥提供新的靶點(diǎn)。
　　2.實(shí)驗(yàn)方法：
　　(1)為了解lin28的表達(dá)是否與乳腺癌的化療耐受相關(guān)，我們以western blot法檢測(cè)了5株乳腺癌細(xì)胞株(SK-BR-3，

3、MCF-7，Beap-37，MDA-231，T47D)中l(wèi)in28的表達(dá)水平，并進(jìn)一步采用MTT比色法檢測(cè)了該5株乳腺癌細(xì)胞株對(duì)paclitaxel的敏感性。
　　(2)為進(jìn)一步明確lin28的表達(dá)水平是否影響乳腺癌細(xì)胞對(duì)paclitaxel的敏感性，我們以lin28 siRNA敲低了高表達(dá)lin28的乳腺癌細(xì)胞株T47D細(xì)胞中l(wèi)in28的表達(dá)，然后采用MTT比色法檢測(cè)lin28敲低前后T47D對(duì)paelitaxel的化療敏感性的

4、變化。
　　(3)為進(jìn)一步證實(shí)lin28的表達(dá)水平在調(diào)節(jié)乳癌細(xì)胞對(duì)paclitaxel化療敏感性中的作用，我們建立了3株穩(wěn)定表達(dá)lin28基因的SK-BR-3細(xì)胞克隆(S1，S24，S27)以及1株穩(wěn)定表達(dá)lin28基因的Bcap-37細(xì)胞克隆(B1)，然后采用MTT比色法檢測(cè)上述穩(wěn)定表達(dá)lin28基因的細(xì)胞克隆對(duì)paclitaxel的化療敏感性的變化。
　　(4)同時(shí)，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)paclitaxel對(duì)上述in28

5、穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞克隆的凋亡的影響。
　　(5)以western blot法檢測(cè)paclitaxel作用lin28穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株S24中PARP的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證lin28抑制paclitaxel對(duì)乳癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。
　　(6)我們以免疫組化法檢測(cè)了乳癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組織及新輔助化療前后乳癌組織中l(wèi)in28表達(dá)的變化，以了解lin28的表達(dá)與腫瘤對(duì)化療敏感性的關(guān)系。
　　(7)為探討lin28誘導(dǎo)乳腺癌paclitaxel耐

6、藥的可能機(jī)制，我們以western blot法檢測(cè)了SK-BR-3/mock細(xì)胞株及其lin28穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞克隆S1，S24，S27沖MRP-1耐藥蛋白以及p21，Rb，cyclib1和AKT等惡性腫瘤重要分子通路基因的表達(dá)。
　　(8)為進(jìn)一步探究lin28誘導(dǎo)乳癌paclitaxel耐藥的機(jī)制，我們以real-time PCR法檢測(cè)了SK-BR-3細(xì)胞株及其lin28穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞克隆S1，S24，S27中l(wèi)in28的下游調(diào)控分

7、子let-7 miRNA的表達(dá)水平。
　　(9)為進(jìn)一步明確let-7 miRNA在介導(dǎo)lin28誘導(dǎo)乳癌細(xì)胞paclitaxel化療耐受中的作用，我們將pre-let-7a miRNA轉(zhuǎn)染到lin28穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株S1中，提高S1細(xì)胞中l(wèi)et-7 miRNA的表達(dá)后，MTT比色法檢測(cè)該細(xì)胞克隆對(duì)paclitaxel的敏感性的變化。
　　3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　(1)5株乳腺癌細(xì)胞株(SK-BR-3，MCF-7，Bcap-37

8、，MDA-231，T47D)中，T47D細(xì)胞的lin28表達(dá)水平明顯高于其他細(xì)胞株，經(jīng)paelitaxel作用后的IC50值(48.20μM)也明顯高于其他細(xì)胞株(4.40μM～9.80μM)。
　　(2)T47D細(xì)胞以siRNA特異性敲低lin28的表達(dá)水平后，測(cè)paclitaxel作用的IC50值明顯低于對(duì)照組(p<0.05)。
　　(3)Lin28穩(wěn)定表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞克隆(S1，S24，S27)對(duì)paclitaxel的

9、敏感性低于對(duì)照組。其IC50值分別為：22.30μM(S1)，32.30μM(S24)和35.60μM(S27)。對(duì)照組的IC50值為：9.90μM。此外，western blot的檢測(cè)結(jié)果表明，在lin28穩(wěn)定表達(dá)的三株細(xì)胞克隆中，S27的表達(dá)強(qiáng)度最強(qiáng)，S1的表達(dá)最弱，與其對(duì)paclitaxel的敏感性呈負(fù)相關(guān)。同樣，在另外一株乳腺癌細(xì)胞株Bcap37穩(wěn)定表達(dá)lin28的細(xì)胞克隆B1也發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照細(xì)胞株(Bcap37/mock)相比，

10、lin28穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株對(duì)paclitaxel更耐藥。Bcap37/mock的IC50值為6.10μM，而在其穩(wěn)定表達(dá)lin28的Bcap37克隆B1的IC50值為28.30μM。
　　(4)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染lin28后，paclitaxel誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率明顯下降.對(duì)lin28穩(wěn)轉(zhuǎn)的SK-BR-3克隆的流式檢測(cè)(PI單染法)顯示：100M paclitaxel作用48小時(shí)后細(xì)胞凋亡率從50.78％(對(duì)照組SK-BR-3/mock)

11、下降至20.47％～30.32％(轉(zhuǎn)染組S1，S24，S27)；40μM paclitaxel作用48小時(shí)后細(xì)胞凋亡率從69.88％(對(duì)照組SK-BR-3/mock)下降至27.61％～36.92％(轉(zhuǎn)染組S1，S24，S27)(p<0.01)。PI-AnnexinV雙染法檢測(cè)也得到了類似的結(jié)果：10μM and40μM紫杉醇作用下，lin28穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆$24的細(xì)胞凋亡率均明顯下降，分別為：42.27％降至17.62％(10μM

12、)，58.81％降至24.71％(40μM)(p<0.01)。結(jié)合單染和雙染的結(jié)果，我們可以發(fā)現(xiàn)S24細(xì)胞經(jīng)紫杉醇作用后的死亡細(xì)胞中，凋亡細(xì)胞所占的比例為75～80％。同樣，另外一株lin28穩(wěn)定表達(dá)克隆B1經(jīng)paclitaxel處理后發(fā)現(xiàn)：Paclitaxel的濃度為5μM時(shí)，細(xì)胞死亡率從28.30％降至5.12％，當(dāng)paclitaxel的濃度為20μM時(shí)，細(xì)胞死亡率從32.85％降至8.56％
　　(5)Western blo

13、t檢測(cè)結(jié)果顯示在母代細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞中，經(jīng)紫杉醇作用后，PARP的裂解產(chǎn)物表達(dá)增加，而lin28穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞S24中PARP的裂解產(chǎn)物表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　(6)免疫組化的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與新輔助化療前比較，在新輔助化療后乳腺癌組織中l(wèi)in28的表達(dá)水平明顯增高。而且，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)乳腺癌標(biāo)本中l(wèi)in28的表達(dá)水平明顯高于新輔助化療前乳腺癌組織以及新輔助化療后乳腺癌組織。
　　(7)Lin28穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株中MRP-1的

14、表達(dá)無(wú)明顯變化，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白P21和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Rb的表達(dá)升高。
　　(8)Lin28穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株中l(wèi)et-7a和let-7b miRNAs的表達(dá)明顯下降。
　　(9)將pre-let-7a miRNA轉(zhuǎn)入Lin28穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株S1中，paclitaxel的IC50值明顯下降(p<0.01)。
　　4.結(jié)論：
　　(1)Lin28的表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞對(duì)paclitaxel的耐受性正相關(guān)。

15、　　(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染lin28基因后可誘導(dǎo)乳癌細(xì)胞對(duì)paelitaxel耐藥。
　　(3)lin28通過(guò)抑制乳癌細(xì)胞的凋亡而誘導(dǎo)紫杉醇耐藥
　　(4)新輔助化療后乳腺癌組織中l(wèi)in28表達(dá)增高，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移乳癌組織中l(wèi)in28的表達(dá)水平高于原發(fā)灶。
　　(5)Lin28可誘導(dǎo)乳癌細(xì)胞中p21和Rb的表達(dá)。
　　(6)Lin28可抑制乳癌細(xì)胞中l(wèi)et-7 miRNAs水平。
　　(7)提高lin28穩(wěn)定表達(dá)乳癌細(xì)胞