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文檔簡介
1、1.實驗背景和目的:
化療耐藥是目前腫瘤治療中所面臨的一個巨大挑戰(zhàn)。目前,在腫瘤耐藥機制研究中最熱門的研究之一是腫瘤干細胞與化療耐藥相關(guān)性的研究。近些年來諸多證據(jù)表明許多惡性腫瘤的耐藥性與其腫瘤干細胞密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)干細胞相關(guān)基因lin28與惡性腫瘤的發(fā)生、進展、預(yù)后以及誘導(dǎo)多功能干細胞形成等密切相關(guān)。另外,我們的前期研究提示lin28在多種惡性腫瘤耐藥細胞株中的表達較其母代細胞株表達水平明顯升高。由此,我們推測作為干細胞相
2、關(guān)基因lin28可能與腫瘤化療耐藥相關(guān).到目前為止,尚未見有關(guān)lin28與腫瘤化療耐藥相關(guān)性研究的報道。本研究目的旨在探討干細胞相關(guān)基因lin28與乳腺癌細胞紫杉醇(paelitaxel,PAC)耐藥的相關(guān)性,并進一步研究其可能的內(nèi)在機制,為克服乳腺癌化療耐藥提供新的靶點。
2.實驗方法:
(1)為了解lin28的表達是否與乳腺癌的化療耐受相關(guān),我們以western blot法檢測了5株乳腺癌細胞株(SK-BR-3,
3、MCF-7,Beap-37,MDA-231,T47D)中l(wèi)in28的表達水平,并進一步采用MTT比色法檢測了該5株乳腺癌細胞株對paclitaxel的敏感性。
(2)為進一步明確lin28的表達水平是否影響乳腺癌細胞對paclitaxel的敏感性,我們以lin28 siRNA敲低了高表達lin28的乳腺癌細胞株T47D細胞中l(wèi)in28的表達,然后采用MTT比色法檢測lin28敲低前后T47D對paelitaxel的化療敏感性的
4、變化。
(3)為進一步證實lin28的表達水平在調(diào)節(jié)乳癌細胞對paclitaxel化療敏感性中的作用,我們建立了3株穩(wěn)定表達lin28基因的SK-BR-3細胞克隆(S1,S24,S27)以及1株穩(wěn)定表達lin28基因的Bcap-37細胞克隆(B1),然后采用MTT比色法檢測上述穩(wěn)定表達lin28基因的細胞克隆對paclitaxel的化療敏感性的變化。
(4)同時,采用流式細胞技術(shù)檢測paclitaxel對上述in28
5、穩(wěn)定表達細胞克隆的凋亡的影響。
(5)以western blot法檢測paclitaxel作用lin28穩(wěn)定表達細胞株S24中PARP的表達,進一步驗證lin28抑制paclitaxel對乳癌細胞的凋亡誘導(dǎo)作用。
(6)我們以免疫組化法檢測了乳癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組織及新輔助化療前后乳癌組織中l(wèi)in28表達的變化,以了解lin28的表達與腫瘤對化療敏感性的關(guān)系。
(7)為探討lin28誘導(dǎo)乳腺癌paclitaxel耐
6、藥的可能機制,我們以western blot法檢測了SK-BR-3/mock細胞株及其lin28穩(wěn)定表達細胞克隆S1,S24,S27沖MRP-1耐藥蛋白以及p21,Rb,cyclib1和AKT等惡性腫瘤重要分子通路基因的表達。
(8)為進一步探究lin28誘導(dǎo)乳癌paclitaxel耐藥的機制,我們以real-time PCR法檢測了SK-BR-3細胞株及其lin28穩(wěn)定表達細胞克隆S1,S24,S27中l(wèi)in28的下游調(diào)控分
7、子let-7 miRNA的表達水平。
(9)為進一步明確let-7 miRNA在介導(dǎo)lin28誘導(dǎo)乳癌細胞paclitaxel化療耐受中的作用,我們將pre-let-7a miRNA轉(zhuǎn)染到lin28穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株S1中,提高S1細胞中l(wèi)et-7 miRNA的表達后,MTT比色法檢測該細胞克隆對paclitaxel的敏感性的變化。
3.實驗結(jié)果:
(1)5株乳腺癌細胞株(SK-BR-3,MCF-7,Bcap-37
8、,MDA-231,T47D)中,T47D細胞的lin28表達水平明顯高于其他細胞株,經(jīng)paelitaxel作用后的IC50值(48.20μM)也明顯高于其他細胞株(4.40μM~9.80μM)。
(2)T47D細胞以siRNA特異性敲低lin28的表達水平后,測paclitaxel作用的IC50值明顯低于對照組(p<0.05)。
(3)Lin28穩(wěn)定表達的乳腺癌細胞克隆(S1,S24,S27)對paclitaxel的
9、敏感性低于對照組。其IC50值分別為:22.30μM(S1),32.30μM(S24)和35.60μM(S27)。對照組的IC50值為:9.90μM。此外,western blot的檢測結(jié)果表明,在lin28穩(wěn)定表達的三株細胞克隆中,S27的表達強度最強,S1的表達最弱,與其對paclitaxel的敏感性呈負相關(guān)。同樣,在另外一株乳腺癌細胞株Bcap37穩(wěn)定表達lin28的細胞克隆B1也發(fā)現(xiàn):與對照細胞株(Bcap37/mock)相比,
10、lin28穩(wěn)定表達細胞株對paclitaxel更耐藥。Bcap37/mock的IC50值為6.10μM,而在其穩(wěn)定表達lin28的Bcap37克隆B1的IC50值為28.30μM。
(4)乳腺癌細胞轉(zhuǎn)染lin28后,paclitaxel誘導(dǎo)的細胞凋亡率明顯下降.對lin28穩(wěn)轉(zhuǎn)的SK-BR-3克隆的流式檢測(PI單染法)顯示:100M paclitaxel作用48小時后細胞凋亡率從50.78%(對照組SK-BR-3/mock)
11、下降至20.47%~30.32%(轉(zhuǎn)染組S1,S24,S27);40μM paclitaxel作用48小時后細胞凋亡率從69.88%(對照組SK-BR-3/mock)下降至27.61%~36.92%(轉(zhuǎn)染組S1,S24,S27)(p<0.01)。PI-AnnexinV雙染法檢測也得到了類似的結(jié)果:10μM and40μM紫杉醇作用下,lin28穩(wěn)定表達的細胞克隆$24的細胞凋亡率均明顯下降,分別為:42.27%降至17.62%(10μM
12、),58.81%降至24.71%(40μM)(p<0.01)。結(jié)合單染和雙染的結(jié)果,我們可以發(fā)現(xiàn)S24細胞經(jīng)紫杉醇作用后的死亡細胞中,凋亡細胞所占的比例為75~80%。同樣,另外一株lin28穩(wěn)定表達克隆B1經(jīng)paclitaxel處理后發(fā)現(xiàn):Paclitaxel的濃度為5μM時,細胞死亡率從28.30%降至5.12%,當(dāng)paclitaxel的濃度為20μM時,細胞死亡率從32.85%降至8.56%
(5)Western blo
13、t檢測結(jié)果顯示在母代細胞及對照細胞中,經(jīng)紫杉醇作用后,PARP的裂解產(chǎn)物表達增加,而lin28穩(wěn)定表達細胞S24中PARP的裂解產(chǎn)物表達無明顯變化。
(6)免疫組化的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),與新輔助化療前比較,在新輔助化療后乳腺癌組織中l(wèi)in28的表達水平明顯增高。而且,結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)乳腺癌標本中l(wèi)in28的表達水平明顯高于新輔助化療前乳腺癌組織以及新輔助化療后乳腺癌組織。
(7)Lin28穩(wěn)定表達的細胞株中MRP-1的
14、表達無明顯變化,細胞周期相關(guān)蛋白P21和細胞凋亡相關(guān)基因Rb的表達升高。
(8)Lin28穩(wěn)定表達的細胞株中l(wèi)et-7a和let-7b miRNAs的表達明顯下降。
(9)將pre-let-7a miRNA轉(zhuǎn)入Lin28穩(wěn)定表達的細胞株S1中,paclitaxel的IC50值明顯下降(p<0.01)。
4.結(jié)論:
(1)Lin28的表達水平與乳腺癌細胞對paclitaxel的耐受性正相關(guān)。
15、 (2)細胞轉(zhuǎn)染lin28基因后可誘導(dǎo)乳癌細胞對paelitaxel耐藥。
(3)lin28通過抑制乳癌細胞的凋亡而誘導(dǎo)紫杉醇耐藥
(4)新輔助化療后乳腺癌組織中l(wèi)in28表達增高,復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移乳癌組織中l(wèi)in28的表達水平高于原發(fā)灶。
(5)Lin28可誘導(dǎo)乳癌細胞中p21和Rb的表達。
(6)Lin28可抑制乳癌細胞中l(wèi)et-7 miRNAs水平。
(7)提高lin28穩(wěn)定表達乳癌細胞
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