Bmi1對話microRNAs在介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞化療耐受中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　乳腺癌是女性中發(fā)病率最高，危害最嚴(yán)重的惡性腫瘤之一，雖然近年來乳腺癌的綜合治療效果有了明顯的改善，然而目前全世界每年仍有近46萬人死于乳腺癌，乳腺癌的化療耐受和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的最重要原因。多年來，雖然對乳腺癌化療耐受的機(jī)制研究取得了一定進(jìn)展，但仍遠(yuǎn)未闡明，近年來的研究提示腫瘤干細(xì)胞可能是導(dǎo)致化療耐受的重要原因。為了進(jìn)一步研究乳腺癌化療耐受的機(jī)制，本課題組前期通過體外誘導(dǎo)建立了獲得性5-Fu耐受的

2、細(xì)胞系MCF-7/5-Fu，該細(xì)胞系表現(xiàn)出明顯的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象(EMT)和乳腺癌干細(xì)胞特性。本課題將以乳腺癌獲得性耐藥細(xì)胞系MCF-7/5-Fu和先天性耐藥細(xì)胞系MDA-MB-231為研究模型，探討B(tài)mi(1)在乳腺癌化療耐受中的作用及其表達(dá)調(diào)控的可能機(jī)制，為識別乳腺癌耐藥新的標(biāo)志物，闡述乳腺癌化療耐藥的分子機(jī)制，開發(fā)以標(biāo)志物為靶的干預(yù)及逆轉(zhuǎn)化療耐藥的藥物提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　(1) RT-qPCR和Weste

3、rn Blot檢測乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MCF-7/5Fu、MDA-MB-231、MDA-MB-453中Bmi1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，MTS試驗檢測各細(xì)胞對5-Fu的敏感性。
　　(2)構(gòu)建Bmi1干擾載體pRNAT-shBmi1，利用過表達(dá)和干擾Bmi1的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，分別用puromycin和Blasticidin篩選建立相應(yīng)穩(wěn)定細(xì)胞系，Western Blot檢測Bmi1及凋亡相關(guān)分子的表達(dá)變化，MTS檢測各細(xì)胞系對5

4、-Fu的敏感性，并計算IC50值。
　　(3)用100mg/L的5-Fu處理過表達(dá)和干擾Bmi1的細(xì)胞系，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡變化情況，酶標(biāo)儀檢測Caspase-9及Caspase-7活性及線粒體凋亡途徑的活化情況。
　　(4)流式細(xì)胞技術(shù)檢測Bmi1干預(yù)后各乳腺癌細(xì)胞系中CD44+/CD24-/low乳腺癌干細(xì)胞亞群比例的變化。
　　(5)生物信息學(xué)預(yù)測靶向Bmi1的microRNAs，選取在各物種間保守性高的mi

5、croRNAs包括miR-200c和miR-203用于進(jìn)一步研究;miRNA特異性實時定量PCR檢測各細(xì)胞系中miR-200c和miR-203的表達(dá)情況。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-200c mimics和miR-203表達(dá)載體pSlience-U6-miR-203導(dǎo)入MCF-7/5-Fu， MDA-MB-231及MDA-MB-453細(xì)胞，miRNA特異性實時定量PCR檢測轉(zhuǎn)染效果，western blot檢測Bmi1的表達(dá)變化;將含有mi

6、R-200c和miR-203結(jié)合位點的Bmi1的3'-端非翻譯區(qū)(3'-UTR)的野生型或結(jié)合位點突變的DNA序列克隆入pMIR-Report報告基因載體，用雙熒光素酶報告實驗檢測miR-200c和miR-203對Bmi1的靶向調(diào)控作用。
　　(6) miRNAs實時定量PCR檢測Bmi1干預(yù)前后各細(xì)胞中miR-200c和miR-203的表達(dá)變化，將野生型p53表達(dá)載體pEGFP-N1-p53導(dǎo)入各細(xì)胞中，實時定量PCR檢測p53

7、轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中miR-200c的表達(dá)變化，Western Blot檢測Bmi1干預(yù)前后p53的表達(dá)變化，并用免疫共沉淀技術(shù)檢測乳腺癌細(xì)胞中Bmi1與p53的結(jié)合情況。
　　結(jié)果：
　　(1)Bmi1mRNA水平在MCF-7、MCF-7/5Fu、MDA-MB-231、MDA-MB-453中無明顯差異，蛋白表達(dá)水平在MCF-7中明顯低于在MCF-7/5Fu、MDA-MB-231和MDA-MB-453中的表達(dá)水平。
　　(2

8、) Bmi1過表達(dá)可明顯增強(qiáng)MCF-7對5-Fu的耐受性，凋亡比例下調(diào);干擾下調(diào)Bmi1表達(dá)可增強(qiáng)MCF-7/5Fu、MDA-MB-231、MDA-MB-453對5-Fu的敏感性，提高凋亡細(xì)胞比例。
　　(3)Bmi1能上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，抑制Bax的表達(dá)，干擾Bmi1的表達(dá)能增加5-Fu誘導(dǎo)的線粒體凋亡途徑的活化，表現(xiàn)為Cyto-C釋放增加，Caspase9和Caspase7活性增加。
　　(4) Bmi1能夠上調(diào)乳腺癌

9、細(xì)胞中CD44+/CD24-干細(xì)胞亞群的比例。
　　(5)生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)Bmi1的3'-UTR各有1個在物種間保守的miRNA200c和miRNA203結(jié)合位點，過表達(dá)miRNA200c和miRNA203能抑制Bmi1的蛋白表達(dá)，雙熒光素酶報告實驗證實miRNA200c和miRNA203能直接靶向調(diào)控Bmi1的蛋白表達(dá)。
　　(6) Bmi1能夠負(fù)向調(diào)控miRNA200c的表達(dá)，而對miR-203的表達(dá)無影響，過表達(dá)野生

10、型p53可上調(diào)miRNA200c的表達(dá)且能逆轉(zhuǎn)Bmi1對miRNA200c的表達(dá)抑制作用。
　　(7)Bmi1能下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中野生型p53的蛋白水平，且和p53存在直接結(jié)合。
　　結(jié)論：
　　1.Bmi1通過抑制線粒體途徑介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的5氟尿嘧啶耐受;
　　2.Bmi1可以上調(diào)乳腺癌CD44+/CD24干細(xì)胞比例群的能力;
　　3.miRNA200c在乳腺癌中能夠靶向調(diào)控Bmi1的表達(dá);
　　4.