乳腺癌細(xì)胞中Vav1蛋白的調(diào)控機(jī)制和功能.pdf

1、本論文共包括兩部分,第一部分:乳腺癌中Vav1蛋白的調(diào)控機(jī)制和功能;第二部分:激酶PKR抑制肽的篩選。
　　第一部分:
　　乳腺癌是女性中致死率最高的癌癥。據(jù)報(bào)道,乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和持久的曝露于雌激素環(huán)境有關(guān)。雌激素受體(estrogen receptor,ER)的表達(dá)和響應(yīng)被視為乳腺癌分類和預(yù)后的重要分子標(biāo)志之一。雌激素受體有兩種亞型,分別是ERα和ERβ。ERα多表達(dá)有乳腺和子宮,而ERβ具有更廣泛的表達(dá)分布,其還表達(dá)于

2、前列腺、卵巢、肺和脾臟。雌激素能夠以配體形式結(jié)合雌激素受體,并引起雌激素受體構(gòu)象發(fā)生變化,使之激活。激活的雌激素受體或通過結(jié)合靶基因啟動上的雌激素反應(yīng)元件(estrogen response element,ERE),或通過結(jié)合啟動子上其他的轉(zhuǎn)錄因子,如AP1、SP1和E2F1,調(diào)控大量基因的表達(dá),從而發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的作用。
　　Vav1最初因其缺失N端后在NIH3T3纖維細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化作用而被認(rèn)為是一個原癌基

3、因,隨后被鑒定為造血細(xì)胞特異性的鳥苷酸交換因子(guaninenucleotide exchange factor, GEF)。一系列的研究表明,Vav1是一個具有多功能結(jié)構(gòu)域的蛋白,它不僅能夠以GEF活性依賴的形式激活RhoGTPase參與淋巴細(xì)胞的細(xì)胞骨架重組,還能以非GEF活性依賴的形式在T細(xì)胞中參與眾多的細(xì)胞過程,如鈣離子動員。
　　同時(shí),越來越多的證據(jù)表明,Vav1蛋白也能夠在非造血細(xì)胞中表達(dá),而且和幾種人類惡性腫瘤相關(guān)

4、,如神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肺癌和胰腺導(dǎo)管腺癌。功能研究發(fā)現(xiàn),在肺癌和胰腺導(dǎo)管腺癌中沉默vav1表達(dá)能夠減少細(xì)胞增殖,而且也能夠減少在裸鼠中腫瘤的大小。另外,Vav1呈陽性的胰腺癌病人比Vav1呈陰性的病人展示出較差的預(yù)后效果以及較低的生存率。這些證據(jù)說明,Vav1蛋白的異常表達(dá)可能對人們癌癥的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用。
　　近來,已有文獻(xiàn)報(bào)道在乳腺癌樣本中檢測到了Vav1的異常表達(dá)。本研究中,我們試圖探討在乳腺癌細(xì)胞中Vav1表達(dá)的機(jī)制及其

5、功能。我們首先用實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative real time PCR,qRT-PCR)的方法在乳腺癌樣本中確認(rèn)了Vav1異常表達(dá)這一結(jié)論。同時(shí)我們也用Western Blot的方法在兩種ER陽性的乳腺癌細(xì)胞系中檢測到了Vav1的表達(dá)。繼而我們發(fā)現(xiàn),在乳腺癌細(xì)胞中,雌激素以一種時(shí)間梯度和濃度梯度依賴的方式通過雌激素受體α亞型上調(diào)vav1基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)。進(jìn)一步地,我們通過報(bào)告基因、染色體免疫共沉淀和蛋白免疫沉淀等手

6、段發(fā)現(xiàn)了ERα通過結(jié)合vav1基因啟動子上的轉(zhuǎn)錄因子c-Myb和ELF-1與vav1基因啟動子相互作用行使對vav1基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。最后,我們發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中沉默vav1表達(dá),能夠抑制細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1的表達(dá)和E2誘導(dǎo)的細(xì)胞周期進(jìn)程,同時(shí)也發(fā)現(xiàn),Vav1過表達(dá)能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖。這些證據(jù)表明,雌激素可能部分地通過上調(diào)Vav1的表達(dá)來調(diào)控乳腺癌的細(xì)胞增殖。
　　第二部分:
　　雙鏈RNA依賴的蛋白激

7、酶(PKR)屬于真核翻譯起始因子eIF2α激酶家族,它通過磷酸化底物eIF2α使蛋白合成終止。PKR主要參與宿主對病毒感染的固有免疫反應(yīng),同時(shí)也在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長、分化和凋亡的控制中起重要作用。PKR活性過高會導(dǎo)致免疫過激的病理反應(yīng)。最近證實(shí)老年癡呆癥中PKR的異常激活導(dǎo)致神經(jīng)元的調(diào)亡。因此,PKR激酶的抑制劑在多種疾病的治療上有很好的應(yīng)用潛力和價(jià)值,是一個被很多人關(guān)注的領(lǐng)域。
　　我們應(yīng)用噬菌體展示12肽庫篩選PKR激酶結(jié)構(gòu)域