Cathepsin B在實(shí)驗(yàn)性腦梗死灶周?chē)瓦h(yuǎn)隔部位損傷與修復(fù)中的作用.pdf

1、研究背景：
　　 腦梗死的損害并不僅僅局限于梗死灶及其周?chē)M織，還波及遠(yuǎn)隔部位，引起繼發(fā)變性。單純保護(hù)腦梗死灶及其周?chē)M織，而忽視腦梗死遠(yuǎn)隔部位的治療將難以取得好的療效。對(duì)缺血腦組織進(jìn)行保護(hù)治療時(shí)，不僅應(yīng)重視對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的直接保護(hù)，促使病變部位的血流恢復(fù)并重新建立血管網(wǎng)，也是神經(jīng)保護(hù)的基本前提。因此，促進(jìn)病變部位的血管新生不失為神經(jīng)保護(hù)的重要策略。
　　 腦梗死灶周存在血管新生(angiogenesis)已經(jīng)得到公認(rèn)，并被

2、認(rèn)為與腦梗死的預(yù)后密切相關(guān)且能促進(jìn)神經(jīng)再生(neurogenesis)。血管新生受血管生成調(diào)節(jié)因子的調(diào)控，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelium growth factor，VEGF)、內(nèi)皮抑素(endostatin，ES)是其中最重要的兩個(gè)。前者是目前已知的最強(qiáng)的血管生成促進(jìn)因子，后者則明顯抑制血管新生。有研究報(bào)道，腦缺血不僅促使梗死灶周VEGF表達(dá)升高，誘導(dǎo)新血管生成，還引起遠(yuǎn)離梗死灶的組織表達(dá)VEGF。然而

3、，局灶腦梗死后遠(yuǎn)隔損害的部位是否存在血管新生甚至神經(jīng)再生，二者在遠(yuǎn)隔損害修復(fù)中起怎樣的作用？尚未見(jiàn)研究報(bào)道。
　　 組織蛋白酶B(cathepsin B，CB)是細(xì)胞死亡的重要介導(dǎo)因子之一，參與梗死灶周組織損傷特別是凋亡過(guò)程。初步研究表明抑制CB能明顯減輕腦梗死灶周損害，是有前景的腦保護(hù)策略之一。然而，目前尚不清楚CB在腦梗死遠(yuǎn)隔損害中的作用，也不清楚CB抑制劑腦保護(hù)的是否還有除了直接保護(hù)以外的機(jī)制。最近有研究提示，CB對(duì)VEG

4、F和ES的生成也有重要的調(diào)節(jié)作用，因而有可能可以通過(guò)調(diào)節(jié)CB的活性來(lái)促進(jìn)腦梗死后的血管新生，實(shí)現(xiàn)對(duì)腦組織的保護(hù)和修復(fù)。
　　 研究目的：
　　 1.觀察成年高血壓大鼠皮層梗死灶周和梗死同側(cè)丘腦CB活性的變化，并探討腹腔注射CB抑制劑Ca-074ME對(duì)腦梗死周組織、同側(cè)紋狀體外側(cè)帶和丘腦腹后核(ventralposterior neuclus，VPN)的保護(hù)作用，以及對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。
　　 2.研究ES和VE

5、GF在梗死灶周和梗死灶同側(cè)VPN的血管新生調(diào)節(jié)中的作用及抑制CB對(duì)其生成的影響。
　　 3.初步探討皮層腦梗死同側(cè)VPN的血管新生和神經(jīng)再生的發(fā)生情況。初步觀察抑制CB對(duì)梗死灶周和同側(cè)VPN血管新生和神經(jīng)再生的影響。
　　 材料和方法：
　　 采用雄性S-D大鼠220只，用雙腎雙夾法復(fù)制易卒中型腎血管性高血壓大鼠(stroke-prone renal vascular hypertensive rats，RHRS

6、P)模型。造模成功后取148只用雙極電凝器閉塞右側(cè)大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端(middle cerebral arteryocclusion，dMCAO)，制作皮層腦梗死模型。隨機(jī)取60只大鼠在dMCAO術(shù)后立即接受Ca-074ME腹腔注射一次(5mg/Kg，溶于1％DMSO)(Ca-074ME組)，另取60只接受等劑量的1％DMSO腹腔注射(DMSO組)，另隨機(jī)選取40只RHRSP大鼠進(jìn)行假手術(shù)做為假手術(shù)對(duì)照組。隨機(jī)抽取部分大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)估，

7、神經(jīng)功能評(píng)估采用Bederson評(píng)分和走橫木試驗(yàn)。dMCAO術(shù)后6小時(shí)、24小時(shí)、3天、7天和14天，隨機(jī)從兩個(gè)dMCAO組中各取12只、從假手術(shù)組取8只大鼠處死，一半用于組織學(xué)檢測(cè)，另一半用于CB酶活性檢測(cè)。CB的酶活性檢測(cè)采用Z-Arg-Arg-AMC做為底物，結(jié)果以每分鐘每克組織釋放的游離AMC的nmol數(shù)表示。采用Nissl染色顯示組織形態(tài)并計(jì)算梗死體積，用免疫組織學(xué)方法檢測(cè)并半定量ES、VEGF以及血管內(nèi)皮標(biāo)記物vWF和內(nèi)源性

8、神經(jīng)干細(xì)胞(neurral stem cells，NSCs)的標(biāo)記物巢蛋白(Nestin)的表達(dá)情況。為明確ES、VEGF和CB表達(dá)細(xì)胞的類(lèi)型以及ES、VEGF與CB的共定位關(guān)系，我們還進(jìn)行了ES/神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase NSE，成熟神經(jīng)元的標(biāo)記物)、ES/膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein GFAP，星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物)、VEGF/GFAP

9、、VEGF/神經(jīng)元特異性核蛋白(neuron specific nuclear proteinNeuN，成熟神經(jīng)元的標(biāo)記物)、CB/NeuN、CB/GFAP、ES/CB以及VEGF/CB的免疫熒光雙標(biāo)的檢測(cè)。同時(shí)，為明確ES表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，我們還進(jìn)行了ES與細(xì)胞凋亡的標(biāo)記物--cleaved caspase-3(Asp175)的免疫熒光雙標(biāo)記檢測(cè)。另外，我們還采用TUNEL法檢測(cè)了梗死灶周的細(xì)胞凋亡。所有圖像均使用NIHImage

10、 J1.31軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布型數(shù)據(jù)以中位數(shù)、四分位數(shù)或百分率表示。全部數(shù)據(jù)均采用社會(huì)科學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件包(Statistical Package for Social Sciences，SPSS) Windows11.0版進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，行單因素方差分析(ANOVA)和非參數(shù)檢驗(yàn)，比較各組間的差異，P<0.05時(shí)，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 CB酶活性：
　　 dMCAO

11、術(shù)后梗死灶周?chē)凸Ｋ劳瑐?cè)VPN的CB活性均增高，并呈動(dòng)態(tài)改變：dMCAO術(shù)后6小時(shí)、24小時(shí)、3天、7天、14天，DMSO組梗死灶周CB活性測(cè)定值依次為：1.24±0.22、1.03±0.13、0.86±0.15、0.87±0.35、0.76±0.19nmol/g·min；Ca-074ME組為：0.93±0.20、0.87±0.24、0.89±0.27、0.83±0.16、0.79±0.21 nmol/g·min；假手術(shù)組為：0.72±

12、0.13、0.67±0.18、0.70±0.11、0.74±0.12、0.69±0.25 nmol/g·min；其中，dMCAO術(shù)后6小時(shí)和24小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，DMSO組與假手術(shù)組之間比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，并且，dMCAO術(shù)后6小時(shí)，Ca-074ME組和DMSO組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012)。
　　 dMCAO術(shù)后，梗死同側(cè)丘腦CB活性亦出現(xiàn)變化，在dMCAO術(shù)后6小時(shí)短暫升高，以后回落，dMC

13、AO術(shù)后7天又升高，并在這一時(shí)間點(diǎn)，DMSO組的CB活性與假手術(shù)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。(dMCAO術(shù)后6小時(shí)、24小時(shí)、3天、7天、14天，DMSO組、Ca-074ME組及假手術(shù)組大鼠丘腦的CB活性依次分別為：0.85±0.28、0.87±0.34、0.69±0.24、0.97±0.20、0.67±0.36和0.79±0.13、0.82±0.22、0.74±0.35、0.81±0.17、0.71±0.27以及0.6

14、3±0.10、0.69±0.21、0.65±0.30、0.64±0.18、0.72±0.15)。
　　 腦梗死體積：
　　 腹腔注射Ca-074ME能縮小腦梗死體積(dMCAO術(shù)后24小時(shí)、3天、7天、14天，Ca-074ME組和DMSO組梗死體積占全腦的體積百分?jǐn)?shù)依次分別為：10.04±2.12、10.28±2.36、8.64±1.55、7.96±1.36和12.96±2.13、13.47±1.61、11.1±1.94

15、、9.70±1.75，前三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值依次為0.037、0.025、0.041。dMCAO術(shù)后14天，兩組梗死體積比較差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0.055)。
　　 神經(jīng)功能評(píng)分：
　　 Ca-074ME能改善皮層腦梗死大鼠的神經(jīng)功能：dMCAO術(shù)后3天的兩組的Bederson評(píng)分(中位數(shù)+/-四分位數(shù))分別為：Ca-074ME組2(1，3) VS DMSO組2(2，3)，兩組比較P=0.02

16、5； dMCAO術(shù)后3、7天，兩組的BMT評(píng)分(中位數(shù)+/-四分位數(shù))分別為：Ca-074ME組4.0(3，4.3)、4.7(3.3，5) VS DMSO組3.0(2，3.7)、4.0(2.7，4.3)，兩組在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩兩比較P值分別為0.043和0.040。
　　 梗死灶周細(xì)胞凋亡：
　　 TUNEL染色顯示，假手術(shù)組腦組織檢測(cè)末見(jiàn)細(xì)胞凋亡，dMCAO術(shù)后梗死灶周?chē)嬖陲@著的細(xì)胞凋亡，在dMCAO術(shù)后6小時(shí)即出現(xiàn)，到

17、dMCAO術(shù)后第3天最明顯。dMCAO術(shù)后24小時(shí)和第3天，Ca-074ME組梗死灶周細(xì)胞凋亡均顯著低于DMSO組(p值分別為0.046和0.040)。
　　 結(jié)論：
　　 1實(shí)驗(yàn)性皮層腦梗死灶周及梗死灶同側(cè)丘腦CB活性升高，參與了局部損害形成。CB特異性抑制劑Ca-074ME能減少梗死灶周細(xì)胞調(diào)亡、縮小腦梗死體積、減輕同側(cè)紋狀體和VPN繼發(fā)變性，并改善神經(jīng)功能。
　　 2實(shí)驗(yàn)性皮層腦梗死灶周ES表達(dá)升高，參與調(diào)