Cathepsin B在喹乙醇致肝損傷中的作用研究.pdf

1、目的：本研究通過建立喹乙醇（Olaquindox，OLA）中毒大鼠模型，初步探討喹乙醇對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠的肝臟功能、炎癥反應(yīng)、氧化損傷、凋亡狀況和組織蛋白酶B（Cathepsin B）蛋白表達(dá)的影響。采用體外細(xì)胞培養(yǎng)研究和應(yīng)用 cathepsin B抑制劑（CBI）干預(yù)觀察其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，探討cathepsin B蛋白在喹乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡機(jī)制中的作用。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步闡明喹乙醇肝損傷機(jī)制提供線索和依據(jù)，同時(shí)也為尋找預(yù)防靶點(diǎn)提供新的信

2、息。
　　方法：1、建立雄性SD大鼠OLA中毒模型：SPF雄性SD大鼠32只，體重180～220g，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組、20mg/kg OLA染毒組、40mg/kg OLA染毒組和60mg/kg OLA染毒組，每組8只。染毒組分別灌胃給不同濃度等體積的OLA水溶液，對(duì)照組同樣方法灌胃給雙蒸水，連續(xù)四周。2、應(yīng)用ELISA方法和試劑盒方法檢測大鼠肝組織中cathepsin B、白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死

3、因子（TNF-α）的含量和血清中谷丙轉(zhuǎn)氨（ALT）酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）和乳酸脫氫酶（LDH）活性；同時(shí)應(yīng)用南京檢測試劑盒檢測肝組織總抗氧化能力（T-AOC）和超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）活性。3、HE染色方法觀察大鼠肝組織病理變化。4、應(yīng)用流式細(xì)胞儀和透射電鏡檢測大鼠肝組織細(xì)胞凋亡水平。5、應(yīng)用免疫組化方法檢測大鼠肝臟cathepsin B蛋白表達(dá)水平。6、

4、建立OLA致人肝癌細(xì)胞HepG-2細(xì)胞損傷模型：采用37℃、5％ CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) HepG-2細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為五組：對(duì)照組、100ug/ml OLA組、200ug/ml OLA組、400ug/ml OLA組、400ug/ml OLA+ CBI組，培養(yǎng)24h后用0.25%胰酶消化細(xì)胞，進(jìn)行指標(biāo)檢測。7、MTT法檢測不同濃度喹乙醇染毒的HepG-2細(xì)胞增殖率。8、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組HepG-2細(xì)胞早期凋亡率和活性氧含量。9、應(yīng)用

5、ELISA方法檢測各組 HepG-2細(xì)胞cathepsin B蛋白含量。10、Western blot方法檢測cathepsin B、caspase-3蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1、OLA染毒對(duì)大鼠肝臟功能的影響：與對(duì)照組比較，隨著OLA染毒劑量的增加，大鼠血清中 ALT、AST、ALP和LDH活性逐漸升高（P＜0.05），且 ALT和AST活性與 OLA染毒劑量正相關(guān)（r=0.967 P=0.033，r=0.980 P=0.02

6、0）。2、OLA染毒對(duì)大鼠肝臟氧化損傷的影響：與對(duì)照組比較，20mg/kg組、40mg/kg組和60mg/kg組大鼠肝組織中 T-AOC和SOD、CAT活性下降（P＜0.05），40mg/kg組和60mg/kg組大鼠肝組織中GSH-PX活性下降（P＜0.05）。3、OLA染毒對(duì)大鼠肝臟炎癥反應(yīng)的影響：染毒組大鼠肝臟匯管區(qū)都有不同程度的炎性細(xì)胞浸潤；隨著OLA染毒劑量的增加大鼠肝組織中 TNF-α和IL-6含量逐漸升高（P<0.05）。4

7、、OLA染毒對(duì)大鼠肝細(xì)胞凋亡狀況的影響：OLA可誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞凋亡，隨 OLA染毒劑量的增加早期凋亡率逐漸升高，40mg/kg組和60mg/kg組早期凋亡率分別升高了231.25%和478.12%（P＜0.05））。5、OLA染毒大鼠肝臟cathepsin B蛋白含量及表達(dá)變化：Cathepsin B主要表達(dá)在大鼠肝臟匯管區(qū)及壞死病灶周圍的細(xì)胞胞漿中，隨著OLA劑量的增加，棕黃色顆粒明顯增多，60mg/kg OLA組細(xì)胞胞漿中棕黃色顆粒

8、沉淀多而密集。與對(duì)照組比較，40mg/kg組和60mg/kg組 cathepsin B蛋白含量分別升高了34.04%、72.34%（P＜0.05）。6、不同濃度OLA對(duì)HepG-2細(xì)胞增殖的影響：OLA可抑制 HepG-2細(xì)胞增殖，隨著染毒劑量的增加，細(xì)胞相對(duì)存活率明顯降低（P＜0.05）。7、CBI對(duì)OLA染毒的HepG-2細(xì)胞增殖的影響：與對(duì)照組比較，OLA染毒組和CBI組細(xì)胞存活率均降低，CBI組細(xì)胞存活率高于OLA染毒組（P＜0

9、.05）。8、CBI對(duì)OLA誘導(dǎo)的HepG-2細(xì)胞凋亡和ROS含量的影響：隨著 OLA染毒劑量的增加，細(xì)胞凋亡率和ROS含量逐漸升高，且400μg/mlOLA+2.5μg/mlCBI組細(xì)胞凋亡率和ROS含量均低于400μg/mlOLA組（P＜0.05）。9、CBI對(duì)OLA染毒的HepG-2細(xì)胞內(nèi)cathepsin B、caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響：隨著 OLA染毒劑量的增加，HepG-2細(xì)胞內(nèi) cathepsin B蛋白含量逐漸

10、升高。400μg/mlOLA+2.5μg/mlCBI組蛋白含量明顯低于400μg/mlOLA組（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，OLA染毒組 cathepsin B和caspase-3表達(dá)水平升高：400μg/mlOLA+2.5μg/mlCBI組cathepsin B和caspase-3表達(dá)水平高于對(duì)照組，但是低于400μg/mlOLA組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：1、OLA可致大鼠肝臟氧化損傷，誘發(fā)肝臟炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡，