Cathepsin B及其結(jié)合蛋白在卵巢癌細胞凋亡中的作用初步研究.pdf

1、細胞凋亡是多細胞生物清除剩余或受損傷的細胞，維持機體平衡，受基因調(diào)控的生理性過程。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)除經(jīng)典的caspases蛋白酶外，位于溶酶體中的半胱氨酸蛋白酶cathepsins特別是cathepsinB(CTSB)也參與介導(dǎo)細胞凋亡過程。Cathepsins既可以與caspases協(xié)同作用也可以不依賴于caspases蛋白酶獨立行使凋亡功能。但目前對于cathepsins在凋亡過程中的調(diào)控機制了解得很少。 PP203是上海市

2、腫瘤研究所通過大規(guī)模功能篩選獲得的人類新基因，GenBank登入號AF258553。TSRCl也是一條功能未知的人類新基因，GenBank登入號BC027478。PP203cDNA長2379bp，編碼蛋白707aa，PP203蛋白具有一個BTB結(jié)構(gòu)域和3個WD40結(jié)構(gòu)域。TSRClcDNA長2071bp，編碼蛋白424aa，TSRCl蛋白具有5個重復(fù)TSPl結(jié)構(gòu)域。PP203和TSRCl基因的組織表達譜分析表明PP203基因在人卵巢、結(jié)

3、腸組織無表達檢出，在前列腺、睪丸和骨骼肌豐度較低，在其余的n種組織(心臟、腦、胎盤、肺、肝、。腎、胰腺、脾臟、胸腺、小腸和白細胞)表達豐度較高。而TSRCl在所檢測的16組織中除腦組織外表達豐度普遍較高。 利用酵母雙雜交技術(shù)，通過篩選人胎肝cDNA文庫，獲得與PP203作用的蛋白CTSB，與TSRCl作用的蛋白bikunin。CTSB是一種位于溶酶體內(nèi)的半胱氨酸蛋白酶，bikunin則是一種Kunitz型蛋白酶抑制劑，在體外可以

4、抑制胰蛋白酶、纖溶酶、顆粒細胞彈性蛋白酶等蛋白酶活性，但其體內(nèi)生理性作用對象尚不知道。進一步研究發(fā)現(xiàn)TSRCl、bikunin也與CTSB結(jié)合。GSTPull-down和coimmunoprecipitation實驗分別在體外和體內(nèi)驗證了CTSB與PP203、TSRCl、bikunin間的結(jié)合作用。熒光共聚焦顯微鏡分析顯示CTSB分別與PP203、TSRCl和bikunin共定位于細胞漿的溶酶體，進一步證實了他們間的相互作用。PP203

5、蛋白通過N端包含BTB結(jié)構(gòu)域的區(qū)域與CTSB結(jié)合，bikunin蛋白則通過C端第二個KU結(jié)構(gòu)域區(qū)段與CTSB作用。 腫瘤壞死因子(TNF)是一種多效細胞因子，其中誘導(dǎo)凋亡的細胞毒性是其一項重要生物學(xué)功能。近期研究證實TNF可以誘導(dǎo)多種細胞溶酶體釋放CTSB等cathepsins蛋白酶進入胞漿，激活細胞凋亡途徑，導(dǎo)致細胞死亡。利用MTT法檢測細胞的存活率，我們篩選了多種卵巢癌、前列腺癌和肝癌細胞株對TNF細胞毒性的敏感性，發(fā)現(xiàn)TN

6、F和轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D合用可以有效地促進卵巢癌細胞OV-90、前列腺癌細胞PC-3和肝癌細胞SMMC-7721死亡，CTSB特異性抑制劑CA074Me和caspases蛋白酶廣譜抑制劑zVAD-fmk能夠有效地保護細胞免受TNF的細胞毒性作用。流式細胞儀檢測(PI-FACS法)也證實CA074Me和zVAD-fmk可以抑制TNF誘導(dǎo)的OV-90細胞凋亡。 利用AO-relocation和AO-uptake方法，我們發(fā)現(xiàn)在TNF

7、誘導(dǎo)卵巢癌OV-90細胞凋亡過程中溶酶體結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞滲漏現(xiàn)象，CTSB特異性抑制劑CA074Me和caspases蛋白酶廣譜抑制劑zVAD-fmk可以保護溶酶體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；另外，熒光共聚焦顯微鏡分析也顯示TNF介導(dǎo)OV-90細胞凋亡過程中，CTSB結(jié)合蛋白TSRCl從溶酶體轉(zhuǎn)位至細胞漿中。 上述結(jié)果說明TNF能夠誘導(dǎo)卵巢癌細胞OV-90凋亡；在凋亡過程中溶酶體結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，釋放內(nèi)容物進入細胞漿：CTSB蛋白酶參與OV-90細胞凋

8、亡途徑。 本文進而研究了CTSB結(jié)合蛋白bilunin、TSRCl和PP203對TNF誘導(dǎo)的卵巢癌細胞OV-90凋亡的影響。Bikunin和PP203瞬時超量表達可以有效地抑制TNF誘發(fā)的OV-90細胞凋亡，TSRCl超量表達則促進OV-90細胞凋亡。對OV-90細胞內(nèi)CTSB活性檢測結(jié)果顯示，bikunin超量表達可以抑制CTSB的蛋白酶活性，TSRCl和PP203超量表達對CTSB酶活無明顯影響。推測bikunin很可能通過

9、抑制CTSB的蛋白酶活性來阻斷TNF誘導(dǎo)的OV-90細胞凋亡途徑。 CTSB在癌癥發(fā)展中的兩重性作用引起研究者關(guān)注，一方面很多癌癥細胞出現(xiàn)CTSB異常高表達，分泌的CTSB促進癌細胞的轉(zhuǎn)移，加劇癌癥病情，另一方面溶酶體內(nèi)的CTSB釋放進入胞漿可以促進細胞凋亡，從而抑制癌癥發(fā)展。本文的研究結(jié)果揭示CTSB參與介導(dǎo)卵巢癌OV-90細胞凋亡，CTSB結(jié)合蛋白bikunin、TSRCl和PP203對于該凋亡過程具有一定調(diào)節(jié)作用，為卵巢癌