調(diào)控XIAP的miRNA篩選及其促卵巢癌細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、目的:
　　上皮性卵巢癌患者五年生存率低的一個重要原因是由于患者對抗腫瘤藥物出現(xiàn)耐藥，即化療藥物所誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡被抑制。XIAP被認(rèn)為是迄今為止作用最強的內(nèi)源性抗凋亡蛋白，在多種腫瘤組織中高表達(dá)，但其在卵巢癌組織中表達(dá)失調(diào)的分子作用機制還不清楚。微小RNA(miRNA)是一類高度保守的非編碼小分子RNA，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥性的形成中起重要作用。故篩選出與XIAP相互作用的miRNA，闡述其參與凋亡調(diào)節(jié)的分子機制非常重要，

2、不僅將揭示一個全新的由miRNA介導(dǎo)的遺傳信息調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，也為腫瘤的早期診斷、療效評估以及疾病預(yù)后的分析提供重要分子依據(jù)，為腫瘤治療提供新的潛在靶點。
　　方法:
　　1.免疫組化及免疫印跡檢驗XIAP在卵巢癌組織及對照卵巢組織中的表達(dá)情況;
　　2.在卵巢癌細(xì)胞中，用慢病毒過表達(dá)XIAP或RNA干擾技術(shù)(siRNA)降低XIAP的表達(dá)，觀察細(xì)胞凋亡情況;
　　3.運用生物信息學(xué)軟件預(yù)測靶向XIAP基因3'UTR的

3、miRNA。綜合文獻報道，從預(yù)測的結(jié)果中找出在卵巢癌組織中低表達(dá)的miRNA，用雙熒光素酶報告基因和miRNA表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞方式進行篩選和驗證。
　　4.選取經(jīng)驗證的作用效果強的miR-155和miR-137，分別用作用位點突變、熒光定量PCR、免疫印跡、siRNA和細(xì)胞凋亡的功能實驗進一步明確每個miRNA對順鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響及可能機制，并在卵巢癌組織樣本及細(xì)胞系中對miR-137與XIAP的表達(dá)水平進行

4、相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:
　　1.XIAP在上皮性卵巢癌組織中高表達(dá)。在卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中過表達(dá)XIAP可抑制順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而降低XIAP的表達(dá)則作用相反。
　　2.綜合軟件預(yù)測與文獻報道的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)既與XIAP3'UTR有相互作用又在卵巢癌組織中低表達(dá)的候選miRNA共22個，用雙熒光素酶報告基因篩選出其中8個miRNA與XIAP3'UTR確有相互作用，其中miR-137，miR-155，miR-142及

5、miR-146a的作用明顯。
　　3.針對作用很強的miR-155和miR-137，本實驗發(fā)現(xiàn)它們均可以降低卵巢癌細(xì)胞SKOV3、A2780的順鉑IC50值，并促進卵巢癌細(xì)胞系及原代培養(yǎng)癌細(xì)胞的順鉑所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。位點突變和凋亡功能回復(fù)實驗都說明是直接通過作用于XIAP3'UTR來抑制XIAP蛋白表達(dá)的。區(qū)別于miR-155，miR-137與XIAP3'UTR有兩個作用位點。進一步分析卵巢癌組織與正常對照樣本的結(jié)果，顯示XIAP

6、在卵巢癌組織中表達(dá)水平明顯升高，miR-137的表達(dá)水平顯著降低，并且兩者的表達(dá)水平負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　XIAP在上皮性卵巢癌組織中表達(dá)水平明顯升高，并能抑制卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性，提示XIAP與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，是導(dǎo)致卵巢癌化療耐藥的重要原因之一。低表達(dá)的miRNA是導(dǎo)致XIAP在卵巢癌組織中表達(dá)升高的重要原因。由于其中的miR-155和miR-137能夠促進順鉑所致的細(xì)胞凋亡，說明這些miRNA很可能通過調(diào)節(jié)