調(diào)控XIAP的miRNA篩選及其促卵巢癌細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、目的:
　　上皮性卵巢癌患者五年生存率低的一個(gè)重要原因是由于患者對(duì)抗腫瘤藥物出現(xiàn)耐藥，即化療藥物所誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡被抑制。XIAP被認(rèn)為是迄今為止作用最強(qiáng)的內(nèi)源性抗凋亡蛋白，在多種腫瘤組織中高表達(dá)，但其在卵巢癌組織中表達(dá)失調(diào)的分子作用機(jī)制還不清楚。微小RNA(miRNA)是一類高度保守的非編碼小分子RNA，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥性的形成中起重要作用。故篩選出與XIAP相互作用的miRNA，闡述其參與凋亡調(diào)節(jié)的分子機(jī)制非常重要，

2、不僅將揭示一個(gè)全新的由miRNA介導(dǎo)的遺傳信息調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，也為腫瘤的早期診斷、療效評(píng)估以及疾病預(yù)后的分析提供重要分子依據(jù)，為腫瘤治療提供新的潛在靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.免疫組化及免疫印跡檢驗(yàn)XIAP在卵巢癌組織及對(duì)照卵巢組織中的表達(dá)情況;
　　2.在卵巢癌細(xì)胞中，用慢病毒過(guò)表達(dá)XIAP或RNA干擾技術(shù)(siRNA)降低XIAP的表達(dá)，觀察細(xì)胞凋亡情況;
　　3.運(yùn)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)靶向XIAP基因3'UTR的

3、miRNA。綜合文獻(xiàn)報(bào)道，從預(yù)測(cè)的結(jié)果中找出在卵巢癌組織中低表達(dá)的miRNA，用雙熒光素酶報(bào)告基因和miRNA表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞方式進(jìn)行篩選和驗(yàn)證。
　　4.選取經(jīng)驗(yàn)證的作用效果強(qiáng)的miR-155和miR-137，分別用作用位點(diǎn)突變、熒光定量PCR、免疫印跡、siRNA和細(xì)胞凋亡的功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確每個(gè)miRNA對(duì)順鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響及可能機(jī)制，并在卵巢癌組織樣本及細(xì)胞系中對(duì)miR-137與XIAP的表達(dá)水平進(jìn)行

4、相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:
　　1.XIAP在上皮性卵巢癌組織中高表達(dá)。在卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中過(guò)表達(dá)XIAP可抑制順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而降低XIAP的表達(dá)則作用相反。
　　2.綜合軟件預(yù)測(cè)與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)既與XIAP3'UTR有相互作用又在卵巢癌組織中低表達(dá)的候選miRNA共22個(gè)，用雙熒光素酶報(bào)告基因篩選出其中8個(gè)miRNA與XIAP3'UTR確有相互作用，其中miR-137，miR-155，miR-142及

5、miR-146a的作用明顯。
　　3.針對(duì)作用很強(qiáng)的miR-155和miR-137，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它們均可以降低卵巢癌細(xì)胞SKOV3、A2780的順鉑IC50值，并促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞系及原代培養(yǎng)癌細(xì)胞的順鉑所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。位點(diǎn)突變和凋亡功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)都說(shuō)明是直接通過(guò)作用于XIAP3'UTR來(lái)抑制XIAP蛋白表達(dá)的。區(qū)別于miR-155，miR-137與XIAP3'UTR有兩個(gè)作用位點(diǎn)。進(jìn)一步分析卵巢癌組織與正常對(duì)照樣本的結(jié)果，顯示XIAP

6、在卵巢癌組織中表達(dá)水平明顯升高，miR-137的表達(dá)水平顯著降低，并且兩者的表達(dá)水平負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　XIAP在上皮性卵巢癌組織中表達(dá)水平明顯升高，并能抑制卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，提示XIAP與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，是導(dǎo)致卵巢癌化療耐藥的重要原因之一。低表達(dá)的miRNA是導(dǎo)致XIAP在卵巢癌組織中表達(dá)升高的重要原因。由于其中的miR-155和miR-137能夠促進(jìn)順鉑所致的細(xì)胞凋亡，說(shuō)明這些miRNA很可能通過(guò)調(diào)節(jié)