RNAi雙向沉默Survivin和XIAP對卵巢癌細胞A2780-cp凋亡的體外研究.pdf

1、背景和目的：Survivin基因和XIAP基因是凋亡抑制因子家族的主要成員，它們在人類多種惡性腫瘤，包括卵巢上皮細胞癌中高表達，起著抑制細胞凋亡的作用，并且腫瘤細胞的化療耐藥性與IAP的高表達有直接的關(guān)系。IAP的高表達，導(dǎo)致化療藥物介導(dǎo)的細胞凋亡在效應(yīng)階段受到抑制，表達下調(diào)可促進腫瘤細胞凋亡和增加腫瘤對化療藥物的敏感性。本實驗運用RNA干擾技術(shù)雙向沉默卵巢癌耐藥細胞株A2780-cp的Survivin基因和XIAP基因后，觀察細胞的凋

2、亡及順鉑對其敏感性的影響，為腫瘤的分子治療奠定實驗基礎(chǔ)。
　　 方法：（1）設(shè)計針對Survivin和XIAP的siRNA，體外化學(xué)合成。（2）用DMEM培養(yǎng)基卵巢癌A2780-cp細胞培養(yǎng)。（3）實驗分組：空白對照組，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組，單轉(zhuǎn)Survivin-siRNA，單轉(zhuǎn)XIAP-siRNA，雙轉(zhuǎn)Survivin-siRNA與XIAP-siRNA組，48小時后收集各組細胞。（4）WesternBlot檢測各組細胞Survivin

3、和XIAP蛋白表達情況。（5）通過PI染色、AnnexinV-FITC流式細胞術(shù)觀察細胞凋亡情況。（6）MTT法檢測轉(zhuǎn)染后及順鉑對細胞增殖的影響。
　　 結(jié)果：（1）Westernblot結(jié)果，共轉(zhuǎn)染siRNA組Survivin和XIAP的蛋白抑制率分別為71.11％、76.81％；單轉(zhuǎn)Survivin-siRNA組的Survivin蛋白抑制率為75.00％，XIAP的蛋白表達與對照組及脂質(zhì)體組比較無明顯下降，而單轉(zhuǎn)XIAP-s

4、iRNA組的XIAP蛋白抑制率高達82.48％，Survivin蛋白表達與對照組及脂質(zhì)體組比較無明顯下降。（2）PI染色結(jié)果顯示細胞調(diào)亡形態(tài)學(xué)變化，轉(zhuǎn)染組細胞減少，可見細胞核固縮、核碎片、發(fā)泡、體積變小及凋亡小體形成，共轉(zhuǎn)染組比單轉(zhuǎn)組結(jié)果更明顯。（3）流式細胞儀檢測細胞早期凋亡率結(jié)果顯示：空白對照組，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組、單轉(zhuǎn)Survivin-siRNA組、單轉(zhuǎn)XIAP-siRNA組、雙轉(zhuǎn)染組的凋亡率分別為1.18％、3.19％、12.82％、

5、11.18％、26.98％；共轉(zhuǎn)染組凋亡率高于兩個單轉(zhuǎn)組及脂質(zhì)體組（P<0.05），單轉(zhuǎn)Survivin-siRNA及單轉(zhuǎn)XIAP-siRNA組之間無差異（P>0.05），空白對照組及脂質(zhì)體組之間無明顯差異（P>0.05）。（4）MTT檢測順鉑對細胞增殖的影響，結(jié)果顯示在同一藥物濃度下，共轉(zhuǎn)染Survivin-siRNA和XIAP-siRNA后，細胞增值率下降明顯，與兩個單轉(zhuǎn)染組及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05），順鉑在細胞

6、增值率為50％時的抑制濃度（IC50）值為（0.10±0.01）μg/mL，單轉(zhuǎn)Survivin-siRNA組的IC50值為（0.61±0.02）μg/mL，單轉(zhuǎn)XIAP-siRNA組的IC50值為（0.62±0.01）μg/mL，而空白對照、脂質(zhì)體組IC50值分別為（11.08±0.01）μg/mL、（9.82±0.02）μg/mL，共轉(zhuǎn)染組的細胞IC50明顯低于各組細胞（p<0.05），兩個單轉(zhuǎn)染組之間沒有明顯差異（p>0.05）。