腎上腺髓質(zhì)素促卵巢癌細(xì)胞遷移作用機(jī)制的研究.pdf

1、卵巢癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤,發(fā)病率在女性常見(jiàn)惡性腫瘤中排名第六位,致死率在女性惡性腫瘤中排名第五位。卵巢癌作為一種高侵襲性的婦科腫瘤,由于出現(xiàn)癥狀時(shí)大多為晚期,盆腹腔廣泛轉(zhuǎn)移病灶,實(shí)施理想的減瘤術(shù)有一定的困難,其五年生存率僅在25-30%。所以研究卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的意義重大。腎上腺髓質(zhì)素(Adrenomedullin AM)是由日本學(xué)者Kitattra等于1993年自人腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)的多肽類,因其在腎上腺髓質(zhì)中的含量高,故

2、被稱為腎上腺髓質(zhì)素。AM在體內(nèi)分布廣泛,有多種生物學(xué)效應(yīng),可作為循環(huán)激素、旁分泌激素及自分泌激素參與體內(nèi)多種生理、病理過(guò)程,在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。
　　 有研究表明,在卵巢癌組織及細(xì)胞系中有AM的受體——降鈣素受體樣受體(CRLR)及受體活性修飾蛋白(RAMPs)的表達(dá)。卵巢癌細(xì)胞系CAOV3可以在bFGF的刺激下自分泌AM,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。這些均證明了AM可能在卵巢癌的發(fā)展中起到重要的作用。
　　 在本實(shí)驗(yàn)

3、中,我們用免疫組化法檢測(cè)并分析了96例中國(guó)患者卵巢癌組織中AM表達(dá)以及臨床預(yù)后意義,并且通過(guò)遷移實(shí)驗(yàn)、蛋白印跡等實(shí)驗(yàn)研究AM在卵巢癌細(xì)胞中的作用及機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1、通過(guò)免疫組化染色SP法,檢測(cè)96例卵巢上皮性癌中AM的表達(dá),本實(shí)驗(yàn)石蠟標(biāo)本取自2004年01月至2008年12月在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院行手術(shù)治療,術(shù)前未行化療和放療,術(shù)后均經(jīng)病理檢查確診的卵巢癌病例。由兩名病理診斷醫(yī)師確定腫瘤的病理學(xué)

4、分型以及組織學(xué)分級(jí)。
　　 2、應(yīng)用不同時(shí)間、不同濃度的AM作用于卵巢癌細(xì)胞HO8910上,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移功能。
　　 3、利1用siRNA內(nèi)源性干擾AM受體CRLR,應(yīng)用AM22-52外源性阻斷AM的受體CRLR,觀察AM對(duì)不同細(xì)胞遷移功能的影響。
　　 4、應(yīng)用AM后利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面整合素α5的表達(dá)。
　　 5、利用蛋白印跡法檢測(cè)應(yīng)用AM后細(xì)胞的FAK、paxillin及相關(guān)磷酸化蛋白

5、量的變化。
　　 6、利1用蛋白印跡法檢測(cè)應(yīng)用AM后細(xì)胞的ERK1/2、AKT及磷酸化蛋白量的變化。
　　 7、利用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)整合素α5β1抑制性抗體對(duì)細(xì)胞的遷移能力影響,及對(duì)AM促細(xì)胞遷移作用的影響。
　　 8、利用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PD98059對(duì)細(xì)胞的遷移能力影響,及對(duì)AM促細(xì)胞遷移作用的影響。
　　 9、利用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Wortmannin對(duì)細(xì)胞的遷移能力影響,及對(duì)AM促細(xì)胞遷移作用的影響。
　

6、　 10、利用蛋白印跡法檢測(cè)整合素α5β1抑制性抗體對(duì)細(xì)胞FAK、paxillin蛋白磷酸化的影響,及對(duì)AM促FAK、paxillin磷酸化作用的影響。
　　 11、利用蛋白印跡法檢測(cè)整合素α5β1抑制性抗體對(duì)細(xì)胞ERK1/2、AKT蛋白磷酸化的影響,及對(duì)AM促ERK1/2、AKT磷酸化作用的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 一、AM的表達(dá)與EOC的臨床病理學(xué)參數(shù)相關(guān)性研究:
　　 AM在EOC細(xì)胞的胞膜

7、以及胞漿中表達(dá),部分癌旁間質(zhì)以及血管內(nèi)皮細(xì)胞中也可以見(jiàn)到AM蛋白表達(dá)。AM的表達(dá)與FIGO分期呈正相關(guān),AM高表達(dá)提示不理想的首次減瘤術(shù)。根據(jù)Kaplan-Meier法分析發(fā)現(xiàn)AM高表達(dá)組的無(wú)瘤生存時(shí)間明顯少于低表達(dá)組。并且高表達(dá)組的總生存時(shí)問(wèn)也少于低表達(dá)組。根據(jù)COX單因素風(fēng)險(xiǎn)分析得出AM高表達(dá)是卵巢癌無(wú)瘤生存時(shí)間和總生存時(shí)間的風(fēng)險(xiǎn)因素。
　　 二、AM促進(jìn)卯巢癌細(xì)胞H08910的遷移:
　　 AM促卵巢癌細(xì)胞HO89

8、10的遷移作用為時(shí)問(wèn)依賴性和劑量依賴性。應(yīng)用AM22-52(AM受體抑制劑)外源性干擾細(xì)胞,放入AM22-52的細(xì)胞在劃痕實(shí)驗(yàn)中的愈合率較對(duì)照正常細(xì)胞的愈合率稍降低,并且提前1小時(shí)加入AM22-52可以拮抗AM的促遷移作用。應(yīng)用siRNA干擾CRLR后的細(xì)胞遷移率低于陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞,并且在AM100nM作用后CRLRsiRNA干擾組的細(xì)胞遷移率明顯低于對(duì)照組。
　　 三、外源性AM可以提高H08910細(xì)胞整合素α

9、5β1的表達(dá),并且促進(jìn)下游蛋白FAK,paxillin的磷酸化:
　　 AM提高整合素α5β1活性的表達(dá)。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)陰性對(duì)照細(xì)胞以及AM(100nM)處理后細(xì)胞的整合素α5表達(dá),發(fā)現(xiàn)AM處理后的細(xì)胞表面整合素α5表達(dá)增加。并且AM可以提高FAK、paxillin蛋白磷酸化,但不影響非磷酸化蛋白總量。預(yù)先應(yīng)用整合素α5β1抑制性抗體(5μg/ml),可以抑制AM對(duì)卵巢癌細(xì)胞HO8910的促遷移作用(P=0.000),并可以

10、拮抗AM的促FAK、paxillin磷酸化。
　　 四、AM促進(jìn)細(xì)胞AKT的磷酸化,AKT抑制劑Wortmannin干擾AM的促遷移作用:
　　 外源性增加AM(100nM)15分鐘就可以促進(jìn)AKT磷酸化增加,并且隨作用時(shí)間延長(zhǎng),磷酸化AKT水平增加,60分鐘達(dá)最高,而并不影響非磷酸化的蛋白總量。應(yīng)用PI3K抑制劑Wortmannin(1μM)可以有效抑制AM的促遷移作用,單純應(yīng)用Wortmannin(1μM)不能抑制正

11、常HO8910細(xì)胞遷移。
　　 五、AM可以促進(jìn)ERK1/2的磷酸化,PD98059抑制AM的促細(xì)胞遷移作用:
　　 外源性增加AM(100nM)15分鐘就可以使ERK1/2磷酸化明顯增加,并不影響非磷酸化AKT蛋白總量。應(yīng)用ERK磷酸化抑制劑PD98059(50μM)可以有效抑制AM的促卵巢癌遷移作用,單純應(yīng)用PD98059不抑制正常HO8910細(xì)胞遷移。
　　 六、整合素α5β1參與AM促AKT、ERK1/2

12、磷酸化作用
　　 預(yù)先應(yīng)用整合素α5β1中和性抗體可以部分抑制AM促AKT、ERK1/2磷酸化作用。
　　 結(jié)論：
　　 1、AM的表達(dá)與卵巢癌的臨床FIGO分期呈正相關(guān)。
　　 2、AM與卵巢癌患者的預(yù)后相關(guān)。1
　　 3、AM可以通過(guò)激活CRLR受體促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞遷移。
　　 4、AM促細(xì)胞表面的整合素α5β1表達(dá),其下游的FAK、paxillin同時(shí)被AM激活,促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞遷移。<