IL-6誘導卵巢癌細胞產(chǎn)生化療耐藥的作用及作用機制研究.pdf

1、目的：卵巢癌發(fā)病隱匿，多數(shù)患者確診時已屬晚期，其治療方法主要是徹底的細胞減滅術(shù)和以順鉑和紫杉醇為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，但遠期療效并不甚理想，耐藥的發(fā)生是制約臨床治療的主要因素。近年來研究表明，白細胞介素6(Interleukin6，IL-6)在卵巢癌細胞中高表達，IL-6不僅在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，而且還影響卵巢癌細胞對化療藥物的敏感性。目前關(guān)于IL-6在卵巢癌化療耐藥中的作用及作用機制尚不十分明確，本課題首先觀察了IL-6的表達對

2、卵巢癌細胞化療耐藥的影響，在此基礎(chǔ)上對其作用機制及相關(guān)信號通路進行了初步探討。
　　 方法：應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫印跡(Western Blot)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)和MTT法，對四種國際公認的人上皮性卵巢癌細胞系的IL-6及其受體

3、(IL-6Rα、gp130)表達水平與其化療敏感性及耐藥相關(guān)基因和凋亡抑制基因表達水平進行分析。
　　 在此基礎(chǔ)上，選擇不分泌IL-6但表達其受體，對順鉑和紫杉醇敏感的A2780細胞和高表達IL-6及其受體，對順鉑和紫杉醇耐藥的SKOV3細胞為研究模型：(1)分別應(yīng)用MTT法和RT-PCR技術(shù)觀察外源性IL-6是否影響A2780細胞對順鉑和紫杉醇的敏感性及對耐藥相關(guān)基因和凋亡抑制基因表達的作用；(2)采用脂質(zhì)體法將含正義(sen

4、se，ss)或反義(antisense，as)IL-6 cDNA的表達載體分別轉(zhuǎn)染至A2780和SKOV3細胞，應(yīng)用G418篩選出陽性克隆，并通過ELISA法進行鑒定。采用上述同樣方法對穩(wěn)定表達ss/asIL-6的細胞克隆進行順鉑和紫杉醇敏感性及耐藥相關(guān)基因和凋亡抑制基因表達的檢測；(3)應(yīng)用特異性信號阻斷劑PD98059(MEK1/2抑制劑)和Wortmannin(PI3K抑制劑)，分別觀察其對外源性IL-6或內(nèi)源性過表達IL-6誘導

5、卵巢癌細胞化療耐藥的阻斷作用。
　　 結(jié)果：(1)四種卵巢癌細胞除A2780細胞外均組成性分泌IL-6，其轉(zhuǎn)錄水平與蛋白水平基本一致，且都表達IL-6受體(IL-6Rα、gp130)；(2)四種卵巢癌細胞對順鉑和紫杉醇的敏感性不同，其中A2780細胞最敏感，ES-2細胞次之，CAOV-3和SKOV-3細胞則有不同程度的耐藥；(3)部分耐藥相關(guān)基因和凋亡抑制基因在A2780和ES-2細胞中的表達水平均較低，而在CAOV-3和SKO

6、V-3細胞中的表達水平均較高。(4)外源性IL-6可顯著降低A2780細胞對順鉑和紫杉醇的敏感性，并能以劑量依賴的方式上調(diào)耐藥基因MDR1、GST-π和凋亡抑制基因Bcl-2、Bcl-xL、XIAP的表達；(5)篩選出IL-6低、中、高表達的A2780克隆，分別命名為A2780/ssIL-6L、A2780/ssIL-6M、A2780/ssIL-6H，和IL-6中、高抑制表達的SKOV3克隆，分別命名為SKOV3/asIL-6MI、SKO

7、V3/asIL-6HI，及相應(yīng)的空載體pcDNA3.1(+)/A2780和pcDNA3.1(+)/SKOV3克?。?6)與空載體pcDNA3.1(+)/A2780和未轉(zhuǎn)染的A2780細胞相比，ssIL-6基因轉(zhuǎn)染組細胞對順鉑和紫杉醇的敏感性明顯降低，上述耐藥相關(guān)基因和凋亡抑制基因的表達水平則明顯升高；(7)與空載體pcDNA3.1(+)/SKOV3和未轉(zhuǎn)染的SKOV3細胞相比，asIL-6基因轉(zhuǎn)染組細胞對順鉑和紫杉醇的敏感性顯著增高，上

8、述耐藥相關(guān)基因和凋亡抑制基因的表達水平則明顯降低；(8)特異性信號阻斷劑PD98059和Wortmannin能以劑量依賴的方式分別阻斷由外源性IL-6或內(nèi)源性過表達IL-6誘導的卵巢癌細胞對順鉑和紫杉醇產(chǎn)生的耐藥。
　　 結(jié)論：(1)卵巢癌細胞通過自分泌IL-6可誘導其對傳統(tǒng)化療藥物順鉑和紫杉醇產(chǎn)生耐藥性；(2)IL-6誘導卵巢癌細胞產(chǎn)生化療耐藥的作用可能與上調(diào)耐藥相關(guān)基因MDR1、GST-π和凋亡抑制基因Bcl-2、Bcl-x