β-連環(huán)蛋白在急性肝損傷中的作用研究.pdf

1、一、研究背景和目的： β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是Wnt信號通路中至關(guān)重要的成員之一，對細(xì)胞的生長、再生、分化等起重要的調(diào)節(jié)作用。胞漿中的β-catenin分子在受到Wnt配體的刺激后與轉(zhuǎn)錄因子Tcf4/Lef結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)入核，啟動下游靶基因如c-Myc、CyclinD1、Survivin等的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和凋亡。同時(shí)，β-catenin又與跨膜黏附分子鈣黏附素(cadherin)相連，參與細(xì)胞黏附

2、。肝臟的眾多生理和病理過程與Wnt/β-catenin信號通路，尤其是β-catenin基因的異常改變密切相關(guān)。β-catenin對于肝臟發(fā)育、肝細(xì)胞的增殖和凋亡具有重要調(diào)節(jié)作用，肝細(xì)胞癌和肝胚細(xì)胞瘤也與β-catenin的異常改變有關(guān)。然而，Wnt/β-catenin信號通路，尤其是β-catenin在急性肝損傷中的主要作用尚未明確。 急性肝損傷是一種非常嚴(yán)重的臨床綜合征，死亡率很高。自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、大量飲酒和應(yīng)用

3、肝毒性藥物是其誘因。大量肝細(xì)胞壞死和凋亡是急性肝損傷過程中十分重要的病理學(xué)特征。Fas是介導(dǎo)凋亡信號通路的細(xì)胞表面抗原，當(dāng)與特異的配體或抗體結(jié)合后可以啟動半胱天冬酶級聯(lián)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。小鼠給予抗Fas抗體(Jo2)后可通過誘導(dǎo)大量的細(xì)胞凋亡而引起死亡。細(xì)菌脂多糖(LPS)是一種強(qiáng)誘導(dǎo)物，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和一氧化氮(NO)，誘導(dǎo)由氧化應(yīng)激介導(dǎo)的急性肝損傷。D-半乳糖胺(D-GalN)可以增強(qiáng)嚙齒類動物肝臟對

4、LPS刺激的敏感性，LPS聯(lián)合D-GalN可誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷。 本實(shí)驗(yàn)將運(yùn)用肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin的基因敲除小鼠分別建立抗-Fas抗體和LPS/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性急性肝損傷模型，分別研究β-catenin在兩種急性肝損傷模型中的作用。 二、材料和方法: 1．從美國Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)B6.129-Ctnnbltm2Kem/KnwJ(在β-catenin基因的內(nèi)含子1和6中有Lox P位

5、點(diǎn))和B6．Cg-Tg(Alb-cre)21Mgn/J(有白蛋白增強(qiáng)子/啟動子支配的Cre)小鼠，通過兩種小鼠的2次雜交，繁育出肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin(β-catenin KO)的小鼠并從基因表型(PCR)和肝細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)水平以及免疫組化(抗β-catenin抗體)三方面進(jìn)行鑒定。2．選擇雄性6-8周齡，體重約18-23g Alb-cre：B-cateninloxP/loxP小鼠，隨機(jī)分為Jo2處理組(n=

6、6)、LPS/D-GalN處理組(n=6)和未處理組(n=4)。同窩Alb-cre；B-cateninlosP/+，β-cateninloxP/+，β-cateninloxP/loxP共同做為對照組(Control)，隨機(jī)分為Jo2處理組(n：7)、LPS/D-GalN處理組(n=6)和未處理組(n=4)。Jo2處理組腹腔注射Jo2(0.5ug/g體重)，LPS處理組腹腔注射LPS(80ug/g體重)+D-GalN(800ug/g體重)

7、。處理組于注射后6h脫頸處死，同時(shí)處死未處理組。3．留取血清和肝組織標(biāo)本，(1)通過檢測血清轉(zhuǎn)氨酶水平，HE染色研究肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin對Jo2和LPS/D-GalN誘導(dǎo)的肝損傷程度的影響。(2)通過Real-time PCR檢測炎性因子(TNF-α、IL-6、IFN-γ)的水平，研究肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin對Jo2和LPS/D-GalN誘導(dǎo)的肝損傷炎癥反應(yīng)的影響。(3)、應(yīng)用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末

8、端標(biāo)記法檢測肝細(xì)胞凋亡情況，用Western blot方法檢測肝細(xì)胞凋亡相關(guān)信號通路關(guān)鍵分子(Caspase-3、PARP、Bcl-2)的水平，通過免疫組化的方法檢測P65表達(dá)，研究肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin對Jo2和LPS/D-GalN誘導(dǎo)的肝損傷中肝細(xì)胞凋亡情況以及凋亡相關(guān)信號分予的改變情況。(4)檢測LPS/D-GalN刺激后肝組織iNOS和GSH的表達(dá)水平，研究肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin對氧化應(yīng)激的影響．4．應(yīng)用

9、SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 三、結(jié)果: 1．繁育出肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin小鼠。對轉(zhuǎn)基因小鼠的基因表型鑒定，肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin小鼠的基因表型為：ctnnb純合(-/-)并且Alb-Cre陽性表達(dá)。免疫組化方面，野生型小鼠肝組織中內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞表達(dá)β-catenin；肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin小鼠的肝臟僅在內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上有β-catenin染色，肝細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)β-Cateni

10、n染色。應(yīng)用抗-β-catenin抗體進(jìn)行Western Blot分析證明肝細(xì)胞特異性敲除β-catenin基因的小鼠肝臟β-catenin基因表達(dá)水平明顯低于野生型。 2．在Jo2誘導(dǎo)的急性肝損傷模型中，β-catenin KO組小鼠血清ALT、AST水平明顯高于對照組，P＜0.05；實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示IL-6、IFN-γ水平略高于Control組； HE染色結(jié)果(200X)見β-catenin KO組竇狀隙明顯膨脹、充血

11、，肝細(xì)胞大片嗜酸性壞死，局灶出血，小葉結(jié)構(gòu)紊亂，少量淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤；Control組見竇狀隙輕微腫脹、充血，少量肝細(xì)胞呈嗜酸性變和壞死，小葉結(jié)構(gòu)尚完整，局灶出血，散在淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤。免疫組化結(jié)果β-catenin KO組核陽性的p65染色少于Control組。TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡可見每高倍視野β-catenin KO組凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯高于Control組(P＜0.05)。Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)β-cat

12、enin KO組活化的Caspase-3、PARP表達(dá)高于Control組，Bcl-2水平低于對照組。 3．在LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷模型中，β-catenin KO組血清ALT、AST水平明顯低于對照組(P＜0.05)；實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示β-catenin KO組IL-6、iNOS水平略低于Control組，Bcl-x1水平高于對照組；HE染色結(jié)果(200X)見β-cateninKO組竇狀隙散在膨脹、

13、充血，炎細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞片狀嗜酸性壞死，局灶出血；Control組見竇狀隙嚴(yán)重腫脹、充血，大片狀肝細(xì)胞壞死，炎細(xì)胞浸潤，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂。免疫組化結(jié)果β-catenin KO核陽性的p65染色同Control組相比無明顯差別。TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡可見每高倍視野β-catenin KO組凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯低于Control組(P＜0.05)。Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)B-catenin KO組Caspase-3、PARP表達(dá)低于Co

14、ntrol組，Bcl-2表達(dá)高于對照組。肝組織GSH檢測發(fā)現(xiàn)β-catenin KO組GSH水平高于Control組。 四、結(jié)論: 1．肝細(xì)胞特異性β-catenin基因敲除小鼠在Jo2誘導(dǎo)的急性肝損傷過程中肝損傷程度明顯高于對照組，提示β-catenin基因?qū)as介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡起保護(hù)作用，其機(jī)制可能與β-catenin基因的抗凋亡作用有關(guān)。 2．肝細(xì)胞特異性β-catenin基因敲除小鼠在LPS/D-Gal