胎球蛋白A在急性肝衰竭中的保護(hù)作用研究.pdf

1、目的：(1)探討慢性重型肝炎患者的血清胎球蛋白A (fetuin-A)水平與肝損害程度、預(yù)后及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的關(guān)系。(2)體外觀察在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激下，胎球蛋白A對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMC)分泌TNF-α和IL-6的影響。(3)建立一種簡(jiǎn)便、有效、穩(wěn)定的暴發(fā)性肝衰

2、竭 (fulminant hepatic failure，F(xiàn)HF)動(dòng)物模型，觀察該模型動(dòng)物不同時(shí)間點(diǎn)胎球蛋白A的表達(dá)情況；并用胎球蛋白A對(duì)FHF模型小鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察胎球蛋白A對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝功能、肝臟組織學(xué)改變、肝細(xì)胞凋亡率和病死率的影響，并進(jìn)一步探討可能的機(jī)制。 方法：(1)設(shè)立健康對(duì)照組、慢性肝炎組和慢性重型肝炎組，慢重肝組中分設(shè)恢復(fù)組和未恢復(fù)組，檢測(cè)血清胎球蛋白A、TNF-α、凝血酶原活動(dòng)度、白蛋白和總膽紅素。 (2)常規(guī)分

3、離培養(yǎng)人外周血單個(gè)核細(xì)胞，2％臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)后，分組觀察胎球蛋白A干預(yù)對(duì)上清液中TNF-α和IL-6的表達(dá)量變化(ELISA法)。(3)采用析因試驗(yàn)法，以小鼠24 h病死率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以實(shí)驗(yàn)鼠的血清肝功能和肝組織病理學(xué)改變?yōu)轵?yàn)證指標(biāo)，建立規(guī)范化小鼠FHF模型。(4)利用RT-PCR、western Blot和免疫組化技術(shù)，分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平研究FHF模型小鼠胎球蛋白A的表達(dá)變化。 (5)分組觀察胎球蛋白A的干預(yù)對(duì)模型

4、小鼠的24h病死率、肝功能、肝組織病理改變(HE染色)、肝細(xì)胞凋亡率(原位末端標(biāo)記法，TUNEL)改變和血清中TNF-α和IL-6的水平(ELISA法)的影響。 結(jié)果：(1)血清胎球蛋白A水平在慢性重型肝炎患者(114.02±89.11μg/ml)較健康對(duì)照者(317.75±107.83 μg/ml)和慢性肝炎患者(253.14±206.45 μg/ml)明顯降低(P<0.01)；在慢性重型肝炎患者未恢復(fù)組(82.53±47.9

5、0 μg/ml)較恢復(fù)組(203.05±112.94 μg/ml)明顯降低(P<0.01)；與凝血酶原活動(dòng)度(Rho=0.493，P<0.01)和血清白蛋白水平顯著正相關(guān)(Rho=0.420，P<0.01)，與血清總膽紅素水平顯著負(fù)相關(guān)(Rho=-0.463，P<0.01)；與血清TNF-α水平顯著負(fù)相關(guān)(Rho=-0.378，P<0.01)。(2)胎球蛋白A與精胺的聯(lián)合應(yīng)用顯著抑制了LPS刺激下人PBMC分泌TNF-α(24.89±7

6、.71 pg/ml)和IL-6(112.91±37.80 pg/ml)的水平(P<0.01)。(3)采用析因?qū)嶒?yàn)法篩選出D-GalN 800 mg/kg+LPS 0.04 mg/kg和D-GalN 600 mg/kg+LPS 0.5 mg/kg均為合適建模劑量組合，并通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)確證。(4)在FHF小鼠模型中，隨著肝損傷的加重，胎球蛋白A的表達(dá)逐漸減少，胎球蛋白AmRNA的表達(dá)量下降早于蛋白。免疫組化的結(jié)果顯示胎球蛋白A主要在肝細(xì)胞的胞

7、漿中表達(dá)，部分在胞膜表達(dá)。(5)胎球蛋白A干預(yù)明顯降低FHF小鼠的病死率(由83％降至25％，P<0.05)，明顯降低血清ALT的水平(由291370.76±29241.68nkat/L降至31585.15±4086.35 nkat/L，P<0.05)，降低血清和肝組織中TNF-α和IL-6的水平(P<0.05)，減輕肝組織炎癥壞死程度，減輕肝細(xì)胞凋亡的程度(凋亡指數(shù)由FHF模型組的23.10±7.39降至2.20±2.97，P<0.0

8、5)。 結(jié)論：(1)慢性重型肝炎患者的血清胎球蛋白A水平與肝臟損害嚴(yán)重程度、血清TNF-α水平及預(yù)后密切相關(guān)。(2)胎球蛋白A和精胺合用可以有效抑制LPS刺激下人PBMC釋放TNF-α和IL-6。(3)以析因?qū)嶒?yàn)法建立一種規(guī)范、重復(fù)性好、費(fèi)效比低的FHF模型；在該模型中，隨著肝損傷的加重，胎球蛋白A的表達(dá)逐漸減少；胎球蛋白A的干預(yù)可以改善由D-Galn和LPS誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝衰竭，其可能的機(jī)制之一是通過(guò)抑制TNF-α和IL-6等炎