2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的
  肝組織損傷是各型肝臟疾病的共同病理基礎(chǔ),嚴(yán)重的肝組織損傷將引起肝功能衰竭;干細(xì)胞治療修復(fù)肝組織損傷是目前國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界研究的一個熱點,但由于存在體外富集純化困難、定向分化機制不明等問題而使其應(yīng)用受到限制。胎肝細(xì)胞中富含的具有定向分化功能的干細(xì)胞是干細(xì)胞治療研究中的重要細(xì)胞來源。本研究擬探討建立體外擴增大鼠胚胎肝干細(xì)胞并抑制其分化的培養(yǎng)條件及方法,并在此基礎(chǔ)上,將胎肝干細(xì)胞通過門靜脈植入肝損傷大鼠體內(nèi),觀察肝臟修復(fù)情況,檢測

2、治療前后HNF4α表達(dá)變化,探討HNF4α在胎肝干細(xì)胞促進(jìn)肝組織損傷修復(fù)中的作用。本研究內(nèi)容共分為兩部分:1.體外瓊脂克隆培養(yǎng)對胎肝干細(xì)胞分化的影響;2.HNF4α在胎肝干細(xì)胞促肝組織損傷修復(fù)中的作用。探討這一重要調(diào)節(jié)過程中分子機理將為臨床應(yīng)用胎肝干細(xì)胞移植治療肝臟疾病奠定重要的基礎(chǔ)。
  方法
  1.無菌條件下利用Ⅳ型膠原酶結(jié)合機械消化法制備14d胎齡大鼠胎肝干細(xì)胞懸液。將原代分離得到的大鼠胎肝干細(xì)胞分成兩組,其中一組胚

3、胎肝干細(xì)胞接種至Ⅰ型膠原包被的培養(yǎng)板中,常規(guī)貼壁培養(yǎng)。另一組細(xì)胞則接種至無血清軟瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng);懸浮培養(yǎng)基分為上下兩層,底層為含HGF的1.2%瓊脂,頂層為無血清的0.6%瓊脂,將胎肝干細(xì)胞接種至頂層培養(yǎng)基中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞的生長。培養(yǎng)2周后收集兩組細(xì)胞,電鏡觀察兩組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的差異,流式細(xì)胞儀檢測其CD90.1+、CD49F+等干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)特征,堿性磷酸酶染色檢測其分化狀態(tài)的差異,實時定量PCR檢測兩組細(xì)

4、胞甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)的表達(dá)差異。
  2.為研究HNF4α在胎肝干細(xì)胞促肝組織損傷修復(fù)中的作用,我們采用四氯化碳制作SD大鼠急性化學(xué)性肝損傷模型,造模成功后將肝損傷大鼠隨機分為移植組(20只)和對照組(20只),移植組將胎肝干細(xì)胞經(jīng)門靜脈移植至大鼠肝臟,對照組注射等容劑量的生理鹽水。分別于注射前6h,注射后1,3,5周檢測大鼠血清谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)的表達(dá)水平;取病理組織切片HE染色,

5、觀察肝組織修復(fù)情況;取肝組織切片采用免疫組化及提取部分肝組織蛋白用Westernblot方法檢測肝臟治療前后HNF4α表達(dá)情況。
  結(jié)果
  1.瓊脂克隆培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)部分胎肝干細(xì)胞未能有效增殖并形成克隆的細(xì)胞,這部分細(xì)胞不能在瓊脂培養(yǎng)基中存活,隨后發(fā)生凋亡崩解。剩余的細(xì)胞在2天后開始出現(xiàn)小的由3-5個細(xì)胞組成的細(xì)胞球,隨培養(yǎng)時間的延長,干細(xì)胞球不斷擴大,球內(nèi)細(xì)胞折光性好,連接緊密,未出現(xiàn)分化表現(xiàn),從形態(tài)上判定為干細(xì)胞集落。原代

6、細(xì)胞接種后貼壁速度、分裂增生較慢,24h后相差顯微鏡下可見細(xì)胞貼壁生長,48h后觀察到分裂。1周后貼壁細(xì)胞體積逐漸增大鋪展呈上皮樣,形成集落。生長至90%左右時傳代后增長速度加快,表現(xiàn)出一些分化的特征。
  2.電鏡下觀察,瓊脂克隆培養(yǎng)胎肝干細(xì)胞直徑約7μm~13μm,表面可見少量短小的微絨毛狀突起,整個細(xì)胞大部分被卵圓形胞核所占據(jù),細(xì)胞質(zhì)少,核質(zhì)比例大,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、核糖體等細(xì)胞器不發(fā)達(dá),表現(xiàn)為原始幼稚未分化細(xì)胞特征,即所謂的

7、肝干細(xì)胞。貼壁培養(yǎng)胎肝干細(xì)胞直徑明顯大于瓊脂克隆培養(yǎng),約20~40μm,細(xì)胞核漿比例小,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、核糖體等發(fā)達(dá)細(xì)胞器,顯示出明顯的分化特征,與成熟肝細(xì)胞相似。通過流式分析發(fā)現(xiàn),懸浮克隆培養(yǎng)的胎肝干細(xì)胞球高表達(dá)CD90.1、CD49F,明顯高于貼壁培養(yǎng)培養(yǎng)的胎肝干細(xì)胞。堿性磷酸酶染色,觀察細(xì)胞表面ALP的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)組染色為強陽性,貼壁培養(yǎng)為弱陽性。實時定量PCR檢測結(jié)果則表明,隨著培養(yǎng)時間的增加,貼壁培

8、養(yǎng)組的胎肝干細(xì)胞AFP表達(dá)明顯下降,ALB的表達(dá)呈明顯上升的趨勢(P<0.01)。而懸浮培養(yǎng)組的胎肝干細(xì)胞AFP和ALB的表達(dá)在培養(yǎng)前后未見明顯變化(P>0.05)。
  3.四氯化碳誘導(dǎo)肝損傷模型后,各組SD大鼠根據(jù)肝病理組織顯示不同程度的損傷,經(jīng)胎肝干細(xì)胞移植處理后,對照組大鼠肝功能改善緩慢,ALT,AST明顯高于移植組,移植組大鼠損傷的肝組織逐漸修復(fù),肝功能恢復(fù)正常。第5周移植組大鼠術(shù)后存活率顯著高于對照組。肝組織損傷后,H

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