臍血干細胞定向分化及治療肝衰竭的實驗與臨床研究.pdf

1、目的：通過細胞培養(yǎng)及動物實驗探討人臍血干細胞(humanumbilicalcordbloodstemcell，HUCBSC)在細胞培養(yǎng)條件下及動物體內(nèi)定向分化為有一定功能的肝細胞的條件及能力；HUCBSC和臍血漿對實驗動物肝衰竭的治療效果及其可能機理。通過臨床治療及隨訪觀察人臍血干細胞移植(humanumbilicalcordbloodstemcelltransplantation，HUCBSCT)治療重型病毒性肝炎的臨床療效和不良反應

2、，為建立HUCBSCT治療重型肝炎的新方法提供實驗和臨床依據(jù)。 方法：在HUCBSC定向分化為肝細胞的細胞培養(yǎng)實驗中，采集人臍帶血(humanumbilicalcordblood，HUCB)分離單個核細胞后，在實驗組培養(yǎng)瓶內(nèi)加入成纖維細胞生長因子(fibroblastgrowthfactor，F(xiàn)GF)及促肝細胞生長因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)或FGF加胎肝上清液培養(yǎng)，對照組培養(yǎng)瓶內(nèi)只加FGF培養(yǎng)。

3、觀察細胞生長分化狀況，免疫組化檢測人甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)和人白蛋白(albumin,ALB)。 在HUCBSC分化為肝細胞的動物實驗中采用密度梯度離心法分離人臍帶血單個核細胞(humanumbilicalcordbloodmononuclearcell，HUCBMNC)。SD大鼠一次性腹腔注射10％(V/V)四氯化碳(carbontetrachloride，CCL4)建立急性肝損傷模型。將48小時

4、后存活的大鼠隨機分為人臍血清治療組(A組)、HUCBMNC輸注治療組(B組)、HUCBMNC輸注+免疫抑制劑治療組(C組)。觀察各組大鼠的一般情況并于處理后的不同時間分別隨機處死各組大鼠，取大鼠肝臟組織作病理學檢查及免疫組織化學染色檢測大鼠肝組織中人AFP及人ALB，用人X染色體上的XIST(Xinactive-specifictranscript)基因設計引物，從大鼠石蠟包埋肝臟組織中提取DNA，進行PCR及凝膠電泳分析以檢測大鼠肝臟

5、組織DNA中是否存在人類DNA。 在臍血漿治療大鼠肝衰竭實驗中，經(jīng)腹腔內(nèi)注射CCL4建立大鼠急性肝衰竭模型后，大鼠隨機分為四組：第一組為對照組，第二組為生理鹽水組，第三組為成人血漿組，第四組為臍血漿組。觀察大鼠的存活率、ALT、TBIL及AFP值，并取大鼠肝組織進行組織病理學檢測。 在HUCBSCT治療重型肝炎的臨床觀察實驗中，以低溫離心法分離HUCBSC。重型病毒性肝炎病人被隨機分為四組：第一組為對照(成人血漿)組，第

6、二組為HUCBSCT組，第三組為血漿置換(plasmaexchange，PE)組，第四組為HUCBSCT+PE組。對照組及PE組的病人輸注成人血漿，HUCBSCT組及HUCBSCT+PE組的病人輸注HUCBSC。觀察病人治療前后血ALB、ALT、TBIL、PTA的變化，以及副作用與安全性。并對部分病人進行了療效隨訪。 結(jié)果：HUCBSC定向分化為肝細胞的細胞培養(yǎng)實驗結(jié)果顯示對照組貼壁細胞形態(tài)大多為梭形細胞，可能為成纖維細胞，未見

7、多邊形細胞。實驗組細胞形態(tài)除梭形細胞外，還可見圓形，類圓形及多邊形細胞，呈類肝細胞形態(tài)。實驗組培養(yǎng)細胞的AFP，ALB免疫組化染色為陽性。而對照組培養(yǎng)細胞經(jīng)AFP，ALB免疫組化染色后未見陽性細胞。此外，采用肝素作為抗凝劑采集的HUCBMNC生長分化優(yōu)于采用枸椽酸鈉作為抗凝劑者；HGF的誘導分化效果優(yōu)于胎肝上清液。 HUCBSC分化為肝細胞的動物實驗結(jié)果顯示A組大鼠肝臟組織中未見人AFP及人ALB陽性細胞，B組及C組大鼠第21天

8、和1月時可見到部分人AFP和人ALB陽性細胞，主要分布于匯管區(qū)、肝竇和肝小葉中央靜脈周圍，部分陽性細胞內(nèi)可見雙核。B組和C組大鼠在21天和(或)1月時肝臟內(nèi)可以檢測到人X染色體基因片段存在，在A組大鼠肝臟內(nèi)未見到此片段PCR產(chǎn)物。 臍血漿治療大鼠肝衰竭實驗結(jié)果顯示臍血漿組大鼠存活率高于成人血漿組、生理鹽水組及對照組。臍血漿組大鼠ALT及TBIL值低于成人血漿組、生理鹽水組及對照組。同時臍血漿組的AFP值高于其它三組。大鼠肝組織病

9、理學結(jié)果顯示經(jīng)過五天的臍血漿治療后，肝細胞壞死及單核細胞浸潤明顯減輕，僅見點狀肝細胞壞死，同時可見肝細胞再生。對照組及生理鹽水組可見多小葉的肝細胞壞死及大量的淋巴細胞浸潤，沒有明顯的肝細胞再生。在成人血漿組可見局灶性壞死、中度淋巴細胞浸潤及少數(shù)局灶性肝細胞再生。 HUCBSCT治療重型肝炎的臨床觀察實驗結(jié)果顯示各組病人治療后ALB及PTA均有升高，但HUCBSCT組、PE組及HUCBSCT+PE組升高幅度明顯高于對照組，HUCB

10、SCT組、PE組及HUCBSCT+PE組的TBIL在治療后明顯降低。病人療效隨訪結(jié)果顯示在隨訪期間內(nèi)HUCBSCT組病人的ALB值高于對照組。在治療過程中HUCBSCT組未發(fā)現(xiàn)不良反應及移植物抗宿主病。 結(jié)論：以上細胞培養(yǎng)、動物實驗及臨床治療觀察結(jié)果提示： 1.臍帶血干細胞在促肝細胞生長因子或胎肝上清液的誘導下可以定向分化為能分泌白蛋白及甲胎蛋白的肝細胞。 2.人臍帶血干細胞可以在無免疫缺陷的急性肝損傷SD大鼠體