干細(xì)胞分化及其對(duì)急性肝衰竭大鼠治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究旨在初步了解肝臟卵圓細(xì)胞的分化特性及其機(jī)理；尋找骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的更佳條件；探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植的更佳途徑，了解骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療急性肝衰竭的可行性。 方法:檢測(cè)細(xì)胞因子對(duì)肝干細(xì)胞的調(diào)控作用wBF-344細(xì)胞用不同濃度的細(xì)胞因子HGF、EGF、FGF、胰島素、IL-6、TNF-α作用，24小時(shí)后，通過(guò)H3TDR摻入法檢測(cè)細(xì)胞因子對(duì)肝干細(xì)胞增殖的影響；提取wBF-344細(xì)胞蛋白，用Western

2、blot方法檢測(cè)wBF-344細(xì)胞表面HGF受體(c-met)、EGF受體、FGF-α受體和TGF-β等受體蛋白的表達(dá)；WBF-344細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化WBF-344細(xì)胞以5×103/孔接種于6孔培養(yǎng)板，8h后換分化培養(yǎng)體系：高糖DMEM、10％胎牛血清、HGF10ng～50ng/ml、EGF20ng/ml、Isulinlug/ml、地塞米松lμM。1-5天HGF用50ng/ml，以后改為10ng/ml維持，每3天半量換液一次，連續(xù)培養(yǎng)。

3、在不同時(shí)間收集分化培養(yǎng)的細(xì)胞，提取mRNA，RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞表面ALB、AFPmRNA。取不同分化時(shí)間的細(xì)胞爬片標(biāo)本，免疫組化法檢測(cè)分化細(xì)胞中ALB、AFP蛋白的表達(dá)。提取不同分化時(shí)間的細(xì)胞蛋白，Westernblot方法檢測(cè)細(xì)胞ALB、AFP蛋白的表達(dá)。 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)取小鼠骨髓細(xì)胞懸液，用比重1.073的Percoll分離液分離(2000g，25min)單個(gè)核細(xì)胞，以5×104/孔，接種于直徑45mm

4、的培養(yǎng)皿，37℃5％CO2條件培養(yǎng)。48h更換培養(yǎng)液，棄掉未貼壁細(xì)胞，每3天換液一次。細(xì)胞長(zhǎng)到80％融合時(shí)胰酶消化傳代，以1：3比例傳代擴(kuò)增培養(yǎng)。 體外誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞分化取新分離的骨髓單個(gè)核細(xì)胞，以5×104/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加分化培養(yǎng)體系：高糖DMEM、10％胎牛血清、100ng/mlHGF。每2天半量換液一次，連續(xù)培養(yǎng)，未行傳代。每天觀察細(xì)胞形態(tài)變化。對(duì)照組加等量培養(yǎng)液不加HGF，其他條件同實(shí)驗(yàn)組。取不同分化時(shí)間細(xì)胞

5、，提取細(xì)胞mRNA，半定量RT-PCR法檢測(cè)骨髓干細(xì)胞ALB、AFPmRNA的表達(dá)；取細(xì)胞爬片標(biāo)本，免疫組化法檢測(cè)骨髓干細(xì)胞中ALB、AFP及CK19蛋白的表達(dá)； 檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中葡萄糖-6-磷酸酶的表達(dá)取誘導(dǎo)分化3周的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，洗滌兩次，加入孵育液(0.125％葡萄糖-6-磷酸鉀鹽，0.2mol/LTris馬來(lái)酸鹽，2％硝酸鉛)，置于37℃溫箱孵育20分鐘。蒸餾水洗滌2次，每次2分鐘。加入1％硫化氨，1分鐘后觀察

6、細(xì)胞顯色。 提取并標(biāo)記大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞1.073％Percoll分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，貼壁法對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行純化，培養(yǎng)4周，傳代4次；DAPI標(biāo)記細(xì)胞。7.建立2-AAF肝損傷及肝部分切除肝損傷大鼠模型；門(mén)靜脈和肝內(nèi)分別移植107個(gè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并設(shè)立陰性對(duì)照組。 肝功能檢測(cè)細(xì)胞移植前及移植后1周及3周時(shí)，分別隨機(jī)取6只實(shí)驗(yàn)鼠，心臟采血檢測(cè)血清白蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶。 熒光顯微鏡觀察移植后不同時(shí)間

7、處死實(shí)驗(yàn)鼠，分別取肝組織、肺組織和脾組織，制成5um冰凍切片，熒光顯微鏡觀察DAPI染色陽(yáng)性細(xì)胞在不同組織中的分布。 免疫組化法檢測(cè)各種組織中SRY蛋白陽(yáng)性細(xì)胞制作細(xì)胞移植后不同時(shí)間不同組織的冰凍切片，ABC法檢測(cè)組織中SRY蛋白陽(yáng)性細(xì)胞。觀察分析陽(yáng)性細(xì)胞的分布特征 巢式PCR法檢測(cè)SRY基因提取冰凍組織的基因組DNA。設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，首先以外引物進(jìn)行PCR，然后以首次PCR產(chǎn)物為模板，以內(nèi)引物再次PCR，0.8％瓊脂糖電

8、泳檢測(cè)。 組織病理觀察取細(xì)胞移植前后的肝組織，10％甲醛固定，石蠟切片，HE染色，觀察組織病理改變。 結(jié)果:wBF-344細(xì)胞高水平表達(dá)HGF受體(c-met)、EGF受體、FGF-α受體和TGF-β受體蛋白；HGF、EGF、FGF對(duì)wBF-344細(xì)胞具有促進(jìn)增殖作用，并具劑量效應(yīng)正相關(guān)；TGF-β則可抑制肝干細(xì)胞的生長(zhǎng)，并可誘導(dǎo)wBF-344細(xì)胞發(fā)生凋亡；F-344細(xì)胞在體外能夠向肝細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化。用含10％Fcs的

9、DMEM、HGF、EGF、胰島素及地塞米松組成特異分化體系，對(duì)wBF-344細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，發(fā)現(xiàn)wBF-344可以向肝細(xì)胞分化。在誘導(dǎo)分化的不同時(shí)間點(diǎn)，提取RNA檢測(cè)細(xì)胞AFPmRNA和ALBmRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)作為干細(xì)胞標(biāo)志物的AFP在分化過(guò)程中逐漸減少，在2周后不能測(cè)出。wBF-344細(xì)胞低水平表達(dá)ALB，但在培養(yǎng)分化2周后表達(dá)明顯增加。分化3周后，免疫組化法檢測(cè)提示細(xì)胞表達(dá)ALB和AFP蛋白。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在完全培養(yǎng)

10、液中培養(yǎng)72小時(shí)，去除未貼壁細(xì)胞，此時(shí)貼壁生長(zhǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量稀少，散在存在，多呈細(xì)而小梭形，隨著骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，10天左右細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80％-90％融合，其形態(tài)呈較均一的長(zhǎng)梭形。將這些細(xì)胞再傳代4次，細(xì)胞擴(kuò)增近100倍，細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯改變。用HGF誘導(dǎo)培養(yǎng)兩周時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)小梁樣排列，互相之間形成旋渦結(jié)構(gòu)。2周后小梁結(jié)構(gòu)漸清晰，誘導(dǎo)組中出現(xiàn)圓形細(xì)胞，呈克隆樣生長(zhǎng)。非誘導(dǎo)組細(xì)胞未出現(xiàn)克隆樣生長(zhǎng)，而出現(xiàn)骨小梁樣排列的細(xì)胞群。3

11、周后誘導(dǎo)組梁樣結(jié)構(gòu)逐漸模糊，圓形細(xì)胞死亡，細(xì)胞出現(xiàn)減少趨勢(shì)。非誘導(dǎo)組骨小梁樣結(jié)構(gòu)進(jìn)一步明顯。 半定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)1周時(shí)細(xì)胞表達(dá)少量ALBmRNA，3周時(shí)表達(dá)量最大，誘導(dǎo)2周后撤去HGF組，4周時(shí)未檢測(cè)到ALBmRNA，而誘導(dǎo)3周后撤去HGF組，4周時(shí)仍可檢測(cè)到ALBmRNA；非誘導(dǎo)組各時(shí)間段ALBmRNA始終陰性。新鮮分離的骨髓干細(xì)胞即表達(dá)少量的AFPmRNA，在誘導(dǎo)組分化2周時(shí)AFPmRNA表達(dá)量最大，以后逐漸減

12、少；非誘導(dǎo)組AFPmRNA隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減少，3周時(shí)幾乎測(cè)不出。 免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)3周時(shí)，細(xì)胞ALB及AFP蛋白染色均呈陽(yáng)性，細(xì)胞中ALB、AFP蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。CK19染色始終為陰性。經(jīng)3周誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)組骨髓干細(xì)胞呈葡萄糖6磷酸酶陽(yáng)性，而未誘導(dǎo)組陰性。 2-AAF處理10天時(shí)，大鼠體重明顯減輕，瞼結(jié)膜、鼻腔粘膜及唇周有出血。 2-AAF肝損傷大鼠，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植3周時(shí)，細(xì)胞移植組血清白

13、蛋白明顯高于陰性對(duì)照組(P＜0.05)，經(jīng)門(mén)靜脈和肝內(nèi)注射兩種移植方式結(jié)果相似；肝部分切除肝損傷大鼠，經(jīng)門(mén)靜脈細(xì)胞移植后48小時(shí)細(xì)胞移植組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶明顯低于陰性對(duì)照組，P＜0.05。兩種移植方式進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，移植后3周肝內(nèi)注射移植組血清白蛋白明顯高于經(jīng)門(mén)靜脈移植組。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后的體內(nèi)分布研究顯示：A、熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)不同的移植方式對(duì)移植后細(xì)胞的分布無(wú)明顯影響。移植1周時(shí)，肝臟、肺臟以及脾臟中都可觀察到DAPI標(biāo)

14、記的細(xì)胞。移植后3周時(shí)，2-AAF肝損傷大鼠的肝內(nèi)可見(jiàn)3-6個(gè)DAPI陽(yáng)性細(xì)胞組成的細(xì)胞簇，此細(xì)胞形態(tài)與正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞很相似；而在肝部分切除肝損傷大鼠，僅觀察到單個(gè)或2-3個(gè)DAPI陽(yáng)性細(xì)胞組成的細(xì)胞簇。此時(shí)正常肝臟、肺臟及脾臟中很少見(jiàn)到DAPI標(biāo)記的細(xì)胞。B、免疫組化檢測(cè)細(xì)胞移植后不同組織中的SRY蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植后1周時(shí)肝組織包括正常肝組織與損傷肝組織以及肺組織、脾組織中均存在SRY陽(yáng)性細(xì)胞，但肝組織中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于

15、脾組織和肺組織。移植3周，正常肝組織、肺組織、脾組織很少見(jiàn)到陽(yáng)性細(xì)胞，而損傷肝組織中仍存在部分陽(yáng)性細(xì)胞。在2-AAF肝損傷組可見(jiàn)到4個(gè)以上成簇排列的陽(yáng)性細(xì)胞；而肝部分切除組，陽(yáng)性細(xì)胞多以單個(gè)存在，很少見(jiàn)到4個(gè)以上的陽(yáng)性細(xì)胞簇。C、巢式PCR法檢測(cè)各種組織中的SRY基因，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞移植1周，在受體鼠的肝、肺以及脾組織中均可檢測(cè)到SRY基因。移植3周時(shí)，僅在損傷的肝組織中檢測(cè)到目的片段，并發(fā)現(xiàn)經(jīng)門(mén)靜脈移植和肝內(nèi)直接移植結(jié)果相似。 肝組

16、織病理檢查提示2-AAF可導(dǎo)致肝組織彌漫性損傷，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，腫脹呈氣球樣變。肝部分切除后即時(shí)肝組織無(wú)明顯異常。細(xì)胞移植后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，肝組織病變逐漸改善。 結(jié)論:大鼠肝干細(xì)胞系WBF-344細(xì)胞高水平表達(dá)HGF受體(c-met)、EGF受體、FGF-α受體和TGF-β受體蛋白。HGF、EGF、FGF對(duì)WB-F344細(xì)胞具有促進(jìn)增殖作用，并具有劑量效應(yīng)正相關(guān)。TGF-β則可抑制肝干細(xì)胞的生長(zhǎng)。 在特定的分化條件下

17、，WBF-344細(xì)胞在體外能誘導(dǎo)向肝細(xì)胞分化。 HGFl00ng/ml體外可以誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)ALB及AFP，但不能誘導(dǎo)其表達(dá)CK19；HGF體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的最佳時(shí)期為2-3周；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化是不可逆的，誘導(dǎo)分化3周時(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出肝細(xì)胞的部分功能特征。 大劑量2-AAF可造成大鼠肝組織彌漫性損傷，異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)2-AAF所致肝損傷有一定的治療作用。肝內(nèi)注射移植