肝細(xì)胞包裹用微囊材料的研制及其治療大鼠肝衰竭模型的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、急性肝功能衰竭發(fā)病急，病情十分嚴(yán)重，保守治療效果不佳。肝細(xì)胞移植是治療肝衰竭的行之有效的途徑之一，異體的肝細(xì)胞是很好的種子細(xì)胞，但是異體肝細(xì)胞移植若不使用免疫抑制劑則面臨著受體發(fā)生的急性免疫排斥反應(yīng)。微囊技術(shù)是指由半透膜包被生物活性物質(zhì)的一種結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可以阻遏免疫細(xì)胞以及引起免疫排斥反應(yīng)的大分子抗體，同時(shí)允許氧氣，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和一些具有生物活性的小分子物質(zhì)自由通透，因此微囊能為移植物提供有效的免疫保護(hù)，使其免受異體排斥反應(yīng)。 我們

2、利用海藻酸鈉制備海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉(Alginate-Polylysine-Alginate，APA)和海藻酸鋇-聚賴氨酸-海藻酸鈉(Ba-alginate-Polylysine-Alginate，BPA)微囊，并對(duì)兩種微囊的物理性能、生物相容性、微囊化細(xì)胞的功能發(fā)揮進(jìn)行研究，然后體內(nèi)移植BPA微囊化肝細(xì)胞和共包裹睪丸支持細(xì)胞與肝細(xì)胞治療肝衰竭動(dòng)物模型，旨在進(jìn)一步改進(jìn)微囊制作條件，提高微囊化肝細(xì)胞移植的治療效果，為微囊化肝細(xì)胞

3、移植的深入研究和向臨床過(guò)渡提供理論依據(jù)。 主要研究?jī)?nèi)容包括以下四個(gè)部分： 一、微囊的制備及條件的優(yōu)化通過(guò)調(diào)整靜電液滴法制備微囊的多種影響因素，優(yōu)化制備條件，根據(jù)不同移植物的要求制備不同粒徑大小的微囊，成功制備大小均勻，囊壁光滑的微囊。用于包被肝細(xì)胞，本試驗(yàn)采用靜電場(chǎng)為6kV/1.5cm，泵速度為15ml/h，針頭內(nèi)徑為0.25mm，海藻酸鈉濃度為2％，多聚賴氨酸濃度為0.05％，作用時(shí)間為6min，制備的微囊粒徑為300

4、-400μm。 二、微囊的物理與生物學(xué)性能評(píng)價(jià)1．采用機(jī)械震蕩實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同類型微囊的機(jī)械強(qiáng)度和體外模擬體液長(zhǎng)期培養(yǎng)測(cè)定不同類型微囊的滲透壓強(qiáng)度，結(jié)果表明，BPA微囊比APA微囊具有較高的機(jī)械強(qiáng)度和長(zhǎng)期穩(wěn)定性。 2．采用體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)測(cè)定微囊在肌肉內(nèi)的移植強(qiáng)度以及腹腔移植后的生物相容性，結(jié)果表明：APA微囊肌肉移植一個(gè)月后，可見(jiàn)多數(shù)微囊出現(xiàn)變形，明顯膨脹，纖維化較明顯，而B(niǎo)PA微囊仍然可以保持近似球形，且膨脹率不大，僅有輕度

5、纖維化。微囊腹腔移植后，APA微囊的56天回收率為76.4±8.4％，纖維化包裹的微囊占3.6±1.3％；而B(niǎo)PA微囊的56天回收率為79.4±7.9％，纖維化包裹的微囊占3.5±1.7％。這些結(jié)果說(shuō)明我們制備的BPA微囊比APA微囊的移植強(qiáng)度要好(p<0.005)，生物相容性相似。 3．采用激光掃描共聚焦顯微鏡和FTTC標(biāo)記的Dextran測(cè)得微囊膜的通透性，以了解兩種微囊作為免疫隔離屏障并支持囊內(nèi)細(xì)胞生存的基礎(chǔ)。結(jié)果表明：兩

6、種微囊膜均具有一定的截割范圍，4kD的小分子物質(zhì)可自由擴(kuò)散進(jìn)入微囊內(nèi)；70kDa的中等分子物質(zhì)可部分通過(guò)：而150 kDa的大分子物質(zhì)不能通過(guò)微囊膜。免疫球蛋白分子量最小的IgG近似于150 kDa，這說(shuō)明我們制備的微囊膜可以作為免疫隔離屏障并支持囊內(nèi)細(xì)胞生存。 三、細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)鑒定以及微囊化細(xì)胞的制備1．采用改良的Seglen兩步門(mén)靜脈膠原酶灌注法原代分離大鼠肝細(xì)胞，以血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算肝細(xì)胞的產(chǎn)率，并用0.4％的臺(tái)盼藍(lán)拒

7、染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝細(xì)胞的成活率。若肝細(xì)胞的成活率在90％以下，則加用Percoll細(xì)胞分離液進(jìn)一步純化。 2．制備微囊化肝細(xì)胞，取其培養(yǎng)液與游離肝細(xì)胞的培養(yǎng)液，檢測(cè)白蛋白含量，結(jié)果表明現(xiàn)在體外的培養(yǎng)液中檢測(cè)到白蛋白的分泌兩者差異不大，而且培養(yǎng)過(guò)程中，2周內(nèi)微囊及囊內(nèi)肝細(xì)胞保持完整形態(tài)，幾無(wú)破損，光鏡下動(dòng)態(tài)觀察微囊形態(tài)完整，表面光滑，因此可知BPA微囊不影響肝細(xì)胞功能的發(fā)揮。 四、微囊化肝細(xì)胞移植治療肝衰動(dòng)物模型由于肝衰會(huì)導(dǎo)致肝

8、細(xì)胞的大面積死亡，而肝細(xì)胞壞死時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)的各種酶釋放到血液中，導(dǎo)致酶指標(biāo)增高。因此我們將制備的微囊化肝細(xì)胞或者共包裹的肝細(xì)胞和睪丸支持細(xì)胞移植入肝衰大鼠模型的腹腔，于移植后的1d、3d、7d、2w、3w、4w、5w、6w眼眥靜脈取血，測(cè)血液中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)，白蛋白(ALB)的值，結(jié)果表明：共包裹組的數(shù)值明顯高于單獨(dú)包裹肝細(xì)胞的組，而微囊化肝細(xì)胞組又高于游離的肝細(xì)胞組，證明睪丸支持細(xì)胞的免疫豁免