微囊化肝細(xì)胞移植代償肝功能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝臟是人體最重要的臟器之一，負(fù)責(zé)多種生化功能。由各種急性肝損害病情惡化所引起的急性肝衰竭是嚴(yán)重危及人類生命的疾病。目前臨床上治療急性肝功能衰竭的肝功能重建途徑主要有：同位肝移植、生物人工肝技術(shù)以及肝細(xì)胞移植。肝細(xì)胞移植因其特殊的優(yōu)點(diǎn)，已成為目前最為活躍、前景最為誘人的研究熱點(diǎn)之一，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。但是，它仍有很多問(wèn)題需要解決，主要包括：細(xì)胞源問(wèn)題和細(xì)胞免疫隔離問(wèn)題。 目前研究的另一熱點(diǎn)微囊技術(shù)（microencapsul

2、ation）可以提供有效的免疫隔離屏障。微囊化技術(shù)能夠?yàn)橐浦驳募?xì)胞提供一層選擇性透過(guò)膜，從而使其能夠逃避宿主的免疫排斥反應(yīng)，使移植的細(xì)胞在不需要免疫抑制劑治療的情況下長(zhǎng)期存活，并保持其生物功能。 我們的前期工作已成功建立了ACA微囊制備技術(shù)，制備的ACA微囊具有良好的物理穩(wěn)定性和半透性。體外微囊/細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞可在微囊內(nèi)存活10天左右。然而，體內(nèi)環(huán)境相對(duì)于體外環(huán)境更為復(fù)雜，ACA微囊能否在體內(nèi)發(fā)揮有效的免疫隔離和選擇性物

3、質(zhì)交換作用？微囊化肝細(xì)胞在體內(nèi)能否有效存活？能否對(duì)肝功能進(jìn)行有效代償？這些問(wèn)題的深入探討無(wú)疑將有助于細(xì)胞移植技術(shù)的發(fā)展。 基于研究現(xiàn)狀以及本研究組前期的工作結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)擬采用微囊化肝細(xì)胞腹腔內(nèi)移植的方法，以觀察移植肝細(xì)胞在體內(nèi)的存活能力、微囊的免疫隔離作用以及微囊化細(xì)胞對(duì)急性肝功能衰竭的代償能力。本研究旨在探討微囊化肝細(xì)胞體內(nèi)移植的可行性，為將來(lái)臨床應(yīng)用提供必要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法： 1．采用自制微囊制備

4、儀制備海藻酸鈉—?dú)ぞ厶牵ˋCA）微囊，用人肝細(xì)胞L—O2進(jìn)行微囊化包裹，通過(guò)腹腔移植的方法植入正常SD大鼠體內(nèi)，然后于移植后的第1、2、4、7天采取剪尾取血進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，并且取動(dòng)物臟器脾臟、胸腺作HE切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，然后，綜合各項(xiàng)指標(biāo)觀察微囊的免疫隔離作用。 2．D—氨基半乳糖胺（D—gal）作為肝臟毒劑，構(gòu)建SD大鼠急性肝衰竭模型。以此為基礎(chǔ)，通過(guò)腹腔移植途徑分別植入微囊化肝細(xì)胞和游離肝細(xì)胞。然后，結(jié)合多項(xiàng)血生化指標(biāo)檢測(cè)

5、植入細(xì)胞對(duì)肝功能衰竭的代償作用，并進(jìn)行各組動(dòng)物生存率的比較。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1．微囊化肝細(xì)胞L—O2移植實(shí)驗(yàn)顯示，微囊化人肝細(xì)胞L—O2和游離肝細(xì)胞L—O2經(jīng)移植后，游離組的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與白細(xì)胞計(jì)數(shù)隨著時(shí)間推移逐漸升高，并于第4天達(dá)到最高峰后緩慢下降，而對(duì)照組與微囊組的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞計(jì)數(shù)隨時(shí)間推移無(wú)明顯變化；游離組的淋巴細(xì)胞數(shù)和白細(xì)胞總數(shù)明顯高于微囊組和空白對(duì)照組，而微囊組與對(duì)照組之間則相差不大，基本處于持平狀態(tài)。

6、 2．微囊化肝細(xì)胞BRL移植對(duì)肝衰竭模型動(dòng)物的代償實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞移植后12h，游離組的肝生化指標(biāo)ALT（谷丙轉(zhuǎn)氨酶）、AST（谷草轉(zhuǎn)氨酶）、TBIL（總膽紅素）呈直線上升達(dá)到最高值，而微囊組僅輕微升高；游離組的ALB（白蛋白）于細(xì)胞移植后12h呈下降趨勢(shì)，微囊組變化微?。晃⒛医M的ALT、AST、TBIL數(shù)值明顯低于游離組，ALB數(shù)值則略高于游離組；肝組織切片形態(tài)學(xué)觀察示微囊組較其他兩組的肝臟病理變化有明顯改善。 3．動(dòng)物生

7、存率分析比較，微囊組動(dòng)物的生存率明顯高于其他兩組，其生存率分別為微囊組77．8％（7/9）、游離組50％（5/10）、對(duì)照組20％（3/15）。 結(jié)論： 1．以半乳糖胺D—gal1．4g/kg一次性腹腔注射所構(gòu)建的SD大鼠急性肝衰竭模型，從形態(tài)學(xué)上、血清學(xué)上都能較好地反映急性肝衰竭的狀態(tài)和強(qiáng)度，觀察窗口為1周左右，可以作為肝功能代償實(shí)驗(yàn)的平臺(tái)。 2．以海藻酸鈉/殼聚糖為材料制備的ACA微囊大小均一，形狀規(guī)則，與肝

8、細(xì)胞結(jié)合狀態(tài)良好，是較為理想的細(xì)胞微囊化材料。 3．微囊化肝細(xì)胞L—O2移植實(shí)驗(yàn)顯示，受體動(dòng)物的免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)都明顯低于使用游離L—O2細(xì)胞移植的動(dòng)物。表明肝細(xì)胞的微囊化處理降低了受體動(dòng)物的免疫反應(yīng)強(qiáng)度，ACA微囊起到了有效的免疫隔離作用。 4．微囊化肝細(xì)胞移植對(duì)肝衰竭模型動(dòng)物的代償實(shí)驗(yàn)顯示，微囊化肝細(xì)胞可以明顯提高動(dòng)物的存活率并改善肝功能。這表明微囊具有半透性，肝細(xì)胞所分泌的小分子生物活性物質(zhì)、白蛋白等可透過(guò)微囊發(fā)揮肝細(xì)