小鼠移植肝內(nèi)白介素-6對(duì)移植肝功能恢復(fù)的影響.pdf

1、自1963年首例臨床肝移植開展以來，肝移植經(jīng)歷了40多年曲折但穩(wěn)步發(fā)展的過程，隨著肝移植術(shù)的日益完善，供肝短缺的問題日益突出。為拓寬供肝的來源，新的術(shù)式不斷出現(xiàn)，如活體肝移植，劈離式肝移植，同時(shí)積極利用邊緣性供肝。其中共同存在的問題是如何判斷評(píng)估移植肝的功能恢復(fù)，預(yù)防避免原發(fā)性移植物功能障礙和原發(fā)性無功能。因此研究肝移植術(shù)后肝臟功能恢復(fù)的生物學(xué)特征，對(duì)于減輕移植肝的損傷，促進(jìn)術(shù)后肝功能恢復(fù)具有非常重要的臨床意義。本研究分為三部分，分別探

2、討了小鼠肝移植模型、冷缺血再灌注損傷模型及白介素-6基因缺陷小鼠(IL-6KO)肝移植模型的建立及外源性、內(nèi)源性白介素-6(IL-6)對(duì)肝移植物功能恢復(fù)的重要作用。 第一部分小鼠全肝移植和全肝冷缺血再灌注模型研究背景：肝移植后缺血再灌注損傷及移植物功能恢復(fù)的分子生物學(xué)機(jī)理仍然不明確。對(duì)肝移植過程中損傷和恢復(fù)機(jī)制的認(rèn)識(shí)建立在動(dòng)物模型上，轉(zhuǎn)基因小鼠的開發(fā)利用為認(rèn)識(shí)這些機(jī)制提供了理想的模型。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖墙⒁环€(wěn)定可靠的小鼠全肝移植和全

3、肝冷缺血再灌注模型。 方法：以C57BL/6為供受體建立小鼠全肝移植和全肝冷缺血再灌注模型。移植物保存于4℃UW液，利用袖套(Cuff)技術(shù)行原位肝移植術(shù)。實(shí)驗(yàn)分兩組：動(dòng)脈化組和無動(dòng)脈化組。移植術(shù)后觀察動(dòng)物存活時(shí)間，病理學(xué)DNA復(fù)制等指標(biāo)觀察組織損傷和肝臟再生反應(yīng)。 結(jié)果：動(dòng)脈化組在1、4、8、16小時(shí)的冷保存時(shí)間下30天的存活率是100％、100％、100％、100％；無動(dòng)脈化組在1、4、8、16小時(shí)的冷保存時(shí)間下30

4、天的存活率是100％、100％、100％、0％。短的移植物冷保存時(shí)間(1、4小時(shí))，病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)組織損傷程度不嚴(yán)重，肝組織再生的反應(yīng)也不明顯，有輕微的細(xì)胞分裂增生。8小時(shí)的冷缺血損傷表現(xiàn)明顯，再生反應(yīng)也增強(qiáng)。16小時(shí)冷缺血組織損傷最重，可見廣泛的肝壞死，肝移植物不能存活。肝動(dòng)脈重建后，肝移植物可以耐受16小時(shí)的冷缺血損傷而存活。 結(jié)論：利用Cuff技術(shù)建立的小鼠全肝及冷缺血灌注損傷模型穩(wěn)定可靠，存活率高，手術(shù)技巧和麻醉控制是小

5、鼠移植物存活的關(guān)鍵。冷缺血時(shí)間長短、組織損傷和肝移植物存活密切相關(guān)。無動(dòng)脈化的肝移植物可耐受長達(dá)8小時(shí)的冷缺血損傷，但不能耐受16小時(shí)的冷缺血損傷。動(dòng)脈重建可以使小鼠肝移植物耐受16小時(shí)的冷缺血保存時(shí)間。 第二部分外源性IL-6對(duì)IL-6KO轉(zhuǎn)基因小鼠肝移植功能恢復(fù)的影響研究背景：IL-6是肝組織再生的一個(gè)重要組成部分，應(yīng)用大鼠的肝移植模型已經(jīng)證實(shí)IL-6/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活劑3(STAT-3)途徑是在冷保存損傷后肝移植物功能恢復(fù)

6、中起重要的作用。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖墙L-6KO轉(zhuǎn)基因小鼠肝移植模型，并觀察外源性IL-6對(duì)IL-6缺陷型轉(zhuǎn)基因小鼠移植后，肝移植物再生反應(yīng)的促進(jìn)作用。 方法：以C57BL/6和IL-6KO小鼠作為供、受體建立IL-6KO小鼠全肝移植模型，移植物保存于4CUW液，利用Cuff技術(shù)行原位肝移植，不做肝動(dòng)脈重建。實(shí)驗(yàn)分為6個(gè)組(每組6只)1.C57BL/6→C57BL/6；2.IL-6KO→IL-6KO；3.IL-6KO→IL-6KO+

7、hIL-6；4.C57BL/6→IL-6KO；5.IL-6KO→C57BL/6；6.IL-6KO→C57BL/6+hIL-6。觀察30天動(dòng)物存活期，病理學(xué)檢查：組織學(xué)DNA復(fù)制觀察肝組織再生反應(yīng)。 結(jié)果：用C57BL/6作為供肝來源的受體，無論是C57BL/6或IL-6KO小鼠30天存活率是100％。組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)溴脫氧尿核苷(BrdU)攝取增加，移植肝內(nèi)IL-6水平上升。第2組受體3天存活率是2/6，第5組的7天存活率是1/6

8、，Brdu的攝取和移植肝內(nèi)IL-6水平未見明顯增加。受體死亡原因是繼發(fā)移植肝衰竭所致。但是在接受一次性皮下注射超級(jí)人工重組IL-6(hIL-6)后的受體小鼠，IL-6KO的肝移植物可以在受體內(nèi)存活，表現(xiàn)為存活時(shí)間達(dá)到對(duì)照組的存活時(shí)間。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)證明IL-6缺陷的轉(zhuǎn)基因小鼠的肝移植物不能存活。肝移植物內(nèi)的IL-6上調(diào)是啟動(dòng)功能恢復(fù)過程，保證移植肝存活的重要保證。外源性的hIL-6可以明顯提高IL-6KO小鼠肝移植物的存活率，可

9、能通過促進(jìn)肝組織再生，逆轉(zhuǎn)移植肝的再灌注損傷。 第三部分：骨髓細(xì)胞源性的肝移植物內(nèi)部的IL-6對(duì)移植肝功能恢復(fù)的影響研究背景：IL-6是肝臟再生的必需成分，但是其細(xì)胞來源一直不明確，因此明確IL-6的細(xì)胞來源，對(duì)于移植后早期肝功能恢復(fù)具有重要的臨床治療價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用骨髓移植和肝移植模型研究了對(duì)移植肝功能恢復(fù)起重要作用的IL-6是否源于移植物內(nèi)部的骨髓細(xì)胞。 方法：應(yīng)用骨髓移植模型，我們重建了受體小鼠的骨髓細(xì)胞，包括巨噬

10、細(xì)胞。IL-6KO小鼠經(jīng)致死劑的X線照射，然后行供體(表達(dá)IL-6的C57BL/6)來源的骨髓細(xì)胞移植。對(duì)照租C57BL/6受體也接受IL-6KO的骨髓細(xì)胞。骨髓移植后肝切除和肝移植觀察肝組織的再生能力和肝移植物的存活率。 結(jié)果：骨髓移植模型成功地使雌性的受體表達(dá)雄性供體Y染色體SRY位點(diǎn)。兒-6陽性表達(dá)的小鼠接受IL-6KO的小鼠骨髓細(xì)胞后，肝切除和肝移植模型中表現(xiàn)為肝再生能力受到損害。相反，替代IL-6KO的小鼠骨髓細(xì)胞后，