肝卵圓細(xì)胞移植治療肝纖維化與肝功能不全的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:建立一種穩(wěn)定而確實(shí)可靠的肝卵圓細(xì)胞分離方法,為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:參照Bryon等的報(bào)道,利用攜帶GFP(綠色熒光蛋白)轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠12只,2只作為空白對(duì)照,10只喂以含濃度為0.1％的3,5-二乙酯基-1,4二氫三甲基吡啶(DDC),刺激卵圓細(xì)胞的增生。而后利用兩步酶灌注法分離出肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞,以Sca-1抗體標(biāo)記的免疫磁珠分選方法加以純化分離出攜帶有GFP的SCa-1+細(xì)胞。
　　

2、結(jié)果:DDC喂養(yǎng)小鼠6周后,病理切片結(jié)果顯示肝組織內(nèi)可見(jiàn)明顯的肝卵圓細(xì)胞增生反應(yīng)。分離每只小鼠得可到約106/ml的非肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞,培養(yǎng)擴(kuò)增約5d后可見(jiàn)克隆樣生長(zhǎng)的卵圓細(xì)胞,通過(guò)Sca-1抗體標(biāo)記的免疫磁珠分選提純。電鏡下細(xì)胞直徑10-15μm,呈鋪路石樣排列,多角形,折光性強(qiáng),核大,卵圓形,胞漿少,核仁明顯。經(jīng)過(guò)鑒定,分離得到的Sca-1+細(xì)胞符合卵園細(xì)胞的形態(tài)學(xué)表現(xiàn),也表達(dá)膽管上皮的表面標(biāo)記OV-6及肝細(xì)胞的表面標(biāo)記AFP,分離純度達(dá)

3、95％以上。
　　 結(jié)論:該方法穩(wěn)定可靠,可為肝卵圓細(xì)胞的相關(guān)研究提供較為理想的研究手段。
　　 目的:研究肝卵圓細(xì)胞在治療小鼠肝纖維化疾病中的有效性。
　　 方法:SPF級(jí)C57BL/6小鼠利用皮下注射四氯化碳的方法,建立小鼠肝纖維化模型。40只肝纖維化模型小鼠分為兩大組,將兩大組小鼠根據(jù)是否繼續(xù)皮下注射CCl4分為A、B兩組,其中A組為施予處理后(HOCA或NSA),繼續(xù)皮下注射CCl4,B組為施予處理后(H

4、OCB或NSB),不再皮下注射CCl4,每小組10只小鼠。4周后觀察肝功能各項(xiàng)指標(biāo)、羥脯氨酸及膠原纖維及肝臟的病理改變,比較各組間的差別。
　　 結(jié)果:卵圓細(xì)胞經(jīng)脾臟移植后入肝,在共聚焦激光顯微鏡下可以觀察到肝組織中存在GFP陽(yáng)性細(xì)胞,這些細(xì)胞主要分布于門(mén)脈區(qū)。在A組繼續(xù)皮下注射CCl4時(shí),NSA組的ALT、AST均明顯升高；而HOCA組ALT、AST明顯降低,同時(shí)升高TP、ALB；HOCA組與NSA組兩兩比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

5、(p＜0.05)；在B組未繼續(xù)皮下注射CCl4時(shí),各組ALT、AST均下降,而且下降至近似正常水平,TP和ALB有升高,但兩兩比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。肝臟病理學(xué)檢測(cè),在繼續(xù)皮下注射CCl4情況下,治療組肝纖維化程度有減輕,NSA組則呈典型肝纖維化改變；在未繼續(xù)皮下注射CCl4情況下,兩組肝纖維化程度都有不同程度減輕,HOCB組緩解更為明顯。
　　 結(jié)論:攜帶GFP的基因卵圓細(xì)胞經(jīng)短暫體外培養(yǎng)擴(kuò)增,經(jīng)脾注射肝纖維化

6、小鼠體內(nèi)后,可定植于受者肝臟內(nèi)(主要聚集于匯管區(qū)),并可緩解肝纖維化的進(jìn)展,促進(jìn)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)。
　　 目的:比較肝卵圓細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療小鼠肝纖維化的療效差別。
　　 方法:利用皮下注射四氯化碳的方法,建立小鼠肝纖維化模型。將肝纖維化/肝硬化成模小鼠60只隨機(jī)分為6組,即HOC移植治療組A(HOCA)、HOC移植治療組B(HOCB),MSC移植治療組A(MSCA)和MSC移植治療組B(MSCB),對(duì)照組A(NS

7、A)和對(duì)照組B(NSB),每組10只。根據(jù)不同的組別經(jīng)脾分別輸入卵圓細(xì)胞、生理鹽水(NS)或四氯化碳。4周后觀察肝功能各項(xiàng)指標(biāo)、羥脯氨酸及膠原纖維及肝臟的病理改變,比較各組間的差別。
　　 結(jié)果:SPF級(jí)C57BL/6小鼠85只,其中6只行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提取,79只行肝纖維化模型制作,成功造模64只(成功率81％)。分別對(duì)兩組大鼠肝臟羥脯氨酸及膠原纖維含量這兩項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)兩指標(biāo)在各組間總體比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(p

8、<0.05)。在繼續(xù)皮下注射CCl4情況下,比較各組間差異顯示HOCA組與MSCA組及NSA組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05),而MSCA組與NSA組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)；在未繼續(xù)皮下注射CCl4情況下,進(jìn)一步比較各組間差異顯示三組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。病理組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果,在未繼續(xù)皮下注射CCl4情況下,各組肝纖維化程度都有不同程度減輕,肝纖維化程度HOCB組