急性肝衰竭大鼠微囊化肝細(xì)胞移植后STAT3、HMGB1的變化及意義.pdf

1、[目的]：本實(shí)驗(yàn)將微囊化肝細(xì)胞移植入急性肝衰竭(acuteliverfailure，ALF)大鼠腹腔內(nèi)，檢測大鼠肝功能和肝組織中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白家族(signaltransducersandactivatorsoftranscription，STAT3)、高遷移率族蛋白B1(highmobilitygroupbox1，HMGB1)的含量，動(dòng)態(tài)觀察微囊化肝細(xì)胞移植對(duì)急性肝衰竭大鼠預(yù)后的影響，動(dòng)態(tài)觀察微囊化肝細(xì)胞移植后急性肝衰竭大鼠肝

2、組織STAT3及HMGB1的表達(dá)情況和意義。 [方法]： 1.微囊化大鼠肝細(xì)胞的制備用二步胰酶灌注法對(duì)健康大鼠肝臟進(jìn)行原代肝細(xì)胞分離及純化，海藻酸鈉-多聚賴氨酸-海藻酸鈉制備微囊。 2.用D-氨基半乳糖誘發(fā)急性肝衰竭動(dòng)物模型，18小時(shí)后將造模動(dòng)物隨機(jī)分成3組：Ⅰ組為生理鹽水組，腹腔內(nèi)注射2ml生理鹽水；Ⅱ組為裸肝細(xì)胞移植組，腹腔內(nèi)植入2ml裸肝細(xì)胞懸液，含4×106個(gè)肝細(xì)胞；Ⅲ組為微囊化肝細(xì)胞移植組，腹腔內(nèi)植入2

3、ml微囊化肝細(xì)胞，也含4×106個(gè)肝細(xì)胞。在造模后6、12、24、48、72、120、168h，分別從各組中隨機(jī)取6只大鼠，動(dòng)態(tài)觀察3組大鼠形念學(xué)，監(jiān)測肝生化指標(biāo)，用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測STAT3mRNA、HMGB1mRNA的表達(dá)。另取6只正常大鼠標(biāo)本作為參考值。 [結(jié)果]： 1.原代肝細(xì)胞分離：大鼠肝細(xì)胞用胰酶+EDTA法分離后，每只大鼠肝細(xì)胞產(chǎn)量平均為8×107個(gè)，肝細(xì)胞存活率為91.8

4、3±2.48％。 2.大鼠肝細(xì)胞微囊化后，發(fā)現(xiàn)微囊直徑在400-800μm左右，且肝細(xì)胞在微囊化前后存活率對(duì)照發(fā)現(xiàn)兩者沒有顯著性差異(P＞0.05)。 3.模型建立24h后，大鼠表現(xiàn)為極度虛弱、食欲明顯減退、嗜睡、抽搐、昏迷等。肝臟病理學(xué)表現(xiàn)為肝細(xì)胞大片崩解壞死，肝索解離，小葉結(jié)構(gòu)模糊不清，肝竇明顯擴(kuò)張并出血，小葉內(nèi)及匯管區(qū)有淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤，殘存肝細(xì)胞水腫變性，這表明急性肝功能衰竭動(dòng)物模型成功建立。

5、 4.各組大鼠肝功能檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，造模后6h，ALT、AST和TRil就開始上升，24h均己顯著升高(P＜0.05)。Ⅲ組ALT、AST和TBil顯著下降，ALT在48h、72h、120h和168h與Ⅰ組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，在48h和72h與Ⅱ組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；AST在48h、72h和120h與Ⅰ組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，在48h和72h與Ⅱ組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；TB

6、il在48h、72h、120h和168h與Ⅰ組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，在48h和72h與Ⅱ組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組大鼠生存率分別是26.7％(4/15)、40.0％(6/15)、73.3％(11/15)，Ⅲ組較Ⅰ組、Ⅱ組大鼠生存率有顯著性提高(P≤0.05)。 5.肝組織中STAT3mRNA的表達(dá)在腹腔注射D-GalN后6h即有顯著升高(P＜0.01)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組表達(dá)量

7、在24h均達(dá)最高峰，后漸漸下降，其中Ⅰ組在48h、72h、120h仍保持較高水平，與正常對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Ⅱ、Ⅲ組在24h后表達(dá)量較Ⅰ組顯著下降，24h、48h、120h、168hⅡ組與Ⅰ組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。72h、120h、168hⅢ組與Ⅱ組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。 6.肝組織中HMGB1mRNA的表達(dá)在造模后6h即有顯著升高(P＜0.01)，Ⅰ

8、、Ⅱ、Ⅲ組表達(dá)量在12h均達(dá)最高峰，后漸漸下降，其中Ⅰ組在24h、48h、72h仍保持較高水平，與正常對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；120h與正常對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Ⅱ組、Ⅲ組在24h后表達(dá)量較Ⅰ組顯著下降，48h、72h和120hⅡ組與Ⅰ組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。72h、120hⅢ組與Ⅱ組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 [結(jié)論]： 1.采用胰

9、酶+EDTA法分離的原代肝細(xì)胞存活率和產(chǎn)量均較高，且費(fèi)用低廉，與膠原酶分離法相比，大大節(jié)省了實(shí)驗(yàn)成本，有著廣闊的應(yīng)用前景。 2.藻酸鈉-多聚賴氨酸-海藻酸鈉制備微囊效果理想，肝細(xì)胞的存活率在微囊化前后相比，兩者沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明微囊化過程對(duì)肝細(xì)胞的存活率影響不大。 3.微囊化肝細(xì)胞移植組由于微囊化技術(shù)提供了有效的免疫隔離屏障，改善肝功能較裸肝細(xì)胞移植組更加顯著，說明微囊化肝細(xì)胞移植較裸肝細(xì)胞移植的治療效果更加令人滿意。