急性肝衰竭大鼠微囊化肝細胞移植后VEGF、TGF-β1的變化及意義.pdf

1、目的：本實驗將微囊化肝細胞移植入急性肝衰竭(aCklte liver failure,ALF)大鼠腹腔內(nèi),檢測大鼠肝功能和肝組織中增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigerl,PCNA)、血管內(nèi)皮生長因子(vaSCtllar endothelial growthactor,VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factormFGF)-β1的含量,初步研究微囊化肝細胞移

2、植后肝衰大鼠肝細胞的增殖情況及肝組織中VEGF、TGF-β1的變化和意義. 方法：通過腹腔注射D-氨基半乳糖(D-Gal),建立急性肝衰竭大鼠模型,18小時后將造模動物隨機分成3組:Ⅰ組為生理鹽水組,腹腔內(nèi)注射2ml生理鹽水;Ⅱ組為裸肝細胞移植組,腹腔內(nèi)植入2ml裸肝細胞懸液,含4×10<'6>個肝細胞;Ⅲ組為微囊化肝細胞移植組,腹腔內(nèi)植入2ml微囊化肝細胞,也含4×10<'6>個肝細胞.然后從每組中各取15只大鼠觀察生存率和生

3、存時間.造模后6、12、24、36、48、72、120、168和240h分別從各組中隨機取6只大鼠,留門靜脈血觀察肝功能變化,取肝組織用免疫組織化學(xué)方法檢測VEGF蛋白和PCNA蛋白的表達,用半定量RT-PCR方法檢測VEGFmRNA和TGF-β1 mRNA的表達.另取6只正常大鼠標本作為參考值. 結(jié)果：(1)模型建立24h后,大鼠表現(xiàn)為極度虛弱、食欲明顯減退、嗜睡、抽搐、昏迷等.肝病理學(xué)表現(xiàn)為肝細胞壞死廣泛而嚴重,出現(xiàn)彌漫性的

4、大片壞死,細胞溶解,肝索解離,小葉結(jié)構(gòu)模糊不清,肝竇明顯擴張并出血,小葉內(nèi)及匯管區(qū)有淋巴細胞和巨噬細胞為主的炎癥細胞浸潤,殘存肝細胞水腫變性,這表明急性肝功能衰竭動物模型成功建立. (2)大鼠肝細胞用胰酶+EDTA法分離后,每只大鼠肝細胞產(chǎn)量平均為(8.45+0.97)×10<'7>個,肝細胞存活率為91.83±2.48﹪.光鏡下觀察,肝細胞形態(tài)完整,大小均勻一致,折光性好,4h后已基本貼壁.(3)大鼠肝細胞微囊化后,發(fā)現(xiàn)微囊直徑在60

5、0-800μm左右,且肝細胞在微囊化前后存活率對照發(fā)現(xiàn)兩者沒有顯著性差異(P>0.05). (4)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組大鼠生存率分別是26.7﹪(4/15)、40.0﹪(6/15)、73.3﹪(11/15),Ⅲ組較Ⅰ、Ⅱ組大鼠生存率有顯著性提高(p≤0.05).另外,生存曲線分析可知Ⅰ、Ⅱ組曲線較低,說明該兩組生存率較低;而Ⅲ組生存曲線較高,也同樣說明其生存率較高.(5)各組大鼠肝功能檢驗發(fā)現(xiàn),造模后6h,丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸

6、氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)均已顯著升高(p<0.05),以36～72h之間為著.36h開始,Ⅱ、Ⅲ組ALT、AST較Ⅰ組顯著下降(P<0.05).Ⅲ組在36、48、72h時肝功能下降較II組明顯(P<0.05).另外TBiL在Ⅰ組造模后逐漸升高,72h達最高峰,Ⅱ、Ⅲ組與Ⅰ組相比,48、72、120、168h均顯著下降(P<0.05),其中在36、48、72hⅢ組較Ⅱ組下降更為顯著(P<0.05).(6)免疫組化結(jié)果表明正常組VEGF、PCN

7、A蛋白呈弱陽性或陰性表達,造模后表達量逐漸增多,12h即顯著升高(P<0.05),至48～72h時達高峰.Ⅱ、Ⅲ組VEGF蛋白的表達量在24～120h之間較Ⅰ組升高明顯(P<0.05).48h后,Ⅲ組VEGF蛋白表達量開始明顯高于Ⅱ組,于72h達峰值,下降也較Ⅰ、Ⅱ組緩慢.另外,VEGF陽性細胞主要是肝細胞,壞死區(qū)周圍及血管周圍表達明顯,壞死區(qū)中心則表達量減少.PCNA免疫組化結(jié)果與VEGF變化相一致,Ⅲ組PCNA蛋白表達量比Ⅱ組高,其

8、在48、72、120、168h均有顯著上升(P<0.01). (7)肝組織中VEGFmRNA的表達在腹腔注射D-GalN后6h開始升高(P<0.05),在36～240hⅢ組的表達量明顯高于Ⅰ、Ⅱ(P<0.05).Ⅰ組TGF-βlmRNA的表達在注射D-GalN后6h較正常組顯著升高(P<0.01),48h達最高峰.Ⅱ、Ⅲ組在24h后TGF-βlmRNA的表達量較Ⅰ組顯著下降(P<0.05),Ⅲ組下降更為顯著(與Ⅱ組同一時間點相比,P<0

9、.01). 結(jié)論：1.采用胰酶+EDTA法分離肝細胞,可獲得較高產(chǎn)量和活力的肝細胞,與膠原酶分離法相比,大大節(jié)省了實驗成本.2.肝細胞的存活率在微囊化前后相比,兩者沒有統(tǒng)計學(xué)意義,說明微囊化過程對肝細胞的存活率影響不大.3.微囊化肝細胞移植組改善肝功能較裸肝細胞移植組更加顯著,且生存率得到明顯地提高,說明微囊化肝細胞移植較裸肝細胞移植的治療效果更加令人滿意.4.微囊化肝細胞移植組肝衰大鼠肝組織中VEGF的表達量顯著升高, TGF