急性肝衰竭模型鼠肝細(xì)胞凋亡機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的：
　　 急性肝衰竭死亡率高，治愈率低。其主要病理變化是肝細(xì)胞的大量死亡，從而導(dǎo)致肝功能?chē)?yán)重受損。其臨床特點(diǎn)是肝功能迅速惡化，可引起肝性腦病及凝血功能障礙。急性肝衰竭病因復(fù)雜，在我國(guó)由于病毒性肝炎感染率高，是引起肝衰竭的主要病因，其次可由藥物、植物或化學(xué)品中毒等引起。研究顯示，細(xì)胞凋亡在急性肝衰竭的發(fā)病過(guò)程中起著非常重要的作用。然而，迄今對(duì)于急性肝衰竭肝細(xì)胞發(fā)生大量凋亡的機(jī)理尚缺乏足夠認(rèn)識(shí)。一般而言細(xì)胞凋亡的發(fā)生存在二

2、種機(jī)制：由攜帶凋亡信號(hào)的配體與細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合，將凋亡信號(hào)傳導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，從而啟動(dòng)一系列的生化反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，該途徑即死亡受體途徑；或由細(xì)胞核內(nèi)DNA的損傷誘發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在急性肝衰竭早期是否存在DNA 損傷及DNA 損傷與肝細(xì)胞凋亡的關(guān)系研究尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。為了探討其發(fā)病機(jī)理，本研究利用D-氨基半乳糖加脂多糖建立的小鼠動(dòng)物模型，以彗星實(shí)驗(yàn)、ELLISA、TUNEL等方法探討肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制，包括：
　　

3、 1、研究急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞核DNA損傷的發(fā)生及演變。2、研究急性肝衰竭模型小鼠血清TNF-α濃度的變化及與肝細(xì)胞凋亡的關(guān)系。
　　 3、研究急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞損傷的演變過(guò)程。
　　 4、研究天晴甘平干預(yù)對(duì)急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制。
　　 5、研究阿拓莫蘭干預(yù)對(duì)急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞損傷及凋亡的影響及其機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、腹腔注射D-氨基半乳糖（D－gal

4、n）和脂多糖（LPS），制作急性肝衰竭小鼠模型。
　　 2、、采用彗星實(shí)驗(yàn)從早期開(kāi)始檢測(cè)急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞核DNA的損傷，用Olive 尾矩值表示DNA的損傷程度。
　　 3、采用ELISA法檢測(cè)急性肝衰竭模型小鼠血清TNF-α的濃度。
　　 4、采用HE 染色的方法檢測(cè)急性肝衰竭模型小鼠肝組織的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。
　　 5、采用TUNEL法檢測(cè)急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞的凋亡，并計(jì)算凋亡指數(shù)。

5、　　 6、腹腔注射D-氨基半乳糖（D－galn）和脂多糖（LPS）前3h，實(shí)驗(yàn)組給予天晴甘平灌胃，分別于注射后不同時(shí)間點(diǎn)用彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝細(xì)胞核DNA的損傷。
　　 7、腹腔注射D-氨基半乳糖（D－galn）和脂多糖（LPS）前2h，實(shí)驗(yàn)組給予肌肉注射阿拓模蘭，分別于注射D－galn和LPS后不同時(shí)間點(diǎn)用彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝細(xì)胞核DNA的損傷，用ELISA法檢測(cè)血清TNF-α濃度，用TUNEL檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果：

6、r>　　 1、腹腔注射D-Galn和LPS后0.5h，模型組小鼠肝細(xì)胞核DNA的Olive 尾矩值即明顯增大，至1 h，出現(xiàn)細(xì)胞核DNA 損傷的肝細(xì)胞達(dá)100%，且隨時(shí)間延伸，肝細(xì)胞核DNA的Olive 尾矩值逐漸增加。各組兩兩之間比較，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 2、腹腔注射D-Galn和LPS后0.5 h，模型組小鼠血清TNF-α濃度無(wú)升高；1h 略有升高，但與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；2h以后，升

7、高趨勢(shì)明顯，各組與正常對(duì)照組比較，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 3、腹腔注射D-Galn和LPS 2h，模型組小鼠HE 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞始出現(xiàn)嗜酸性染色增強(qiáng)，至8h 肝細(xì)胞出現(xiàn)大片壞死，肝竇明顯擴(kuò)張充血并出血。
　　 4、腹腔注射D-Galn和LPS后6 h，模型組小鼠TUNEL檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝組織始有凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，至8 h出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞。
　　 5、腹腔注射D-Galn和LPS后，天晴甘平治療

8、組與對(duì)照組比較Olive尾矩值明顯變小，差異具顯著意義（P＜0.05）。
　　 6、腹腔注射D-Galn和LPS后，阿拓模蘭治療組與對(duì)照組比較Olive尾矩值明顯變小，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但血清TNF-α濃度無(wú)明顯改變；在腹腔注射D-Galn和LPS后的6h時(shí)間點(diǎn)，阿拓模蘭治療組的凋亡指數(shù)較對(duì)照組減少，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在8h時(shí)間點(diǎn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1、急性肝衰竭模型小鼠肝

9、細(xì)胞核DNA 較早出現(xiàn)損傷，并隨時(shí)間延伸逐漸加重，最終可能誘發(fā)了肝細(xì)胞凋亡。導(dǎo)致急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞核DNA 損傷的原因可能是D-氨基半乳糖和脂多糖的毒性作用。同時(shí)，本研究HE 染色的結(jié)果也提示，急性肝衰竭肝細(xì)胞壞死的機(jī)理部分也可能與肝細(xì)胞核DNA的損傷有關(guān)。
　　 2、血清TNF-α濃度的升高與肝細(xì)胞核DNA 損傷的發(fā)生及演變不完全同步，但可能具有進(jìn)一步促進(jìn)肝細(xì)胞核DNA損傷的作用。
　　 3、天晴甘平具有減輕急性