肝細胞移植對裸鼠肝銅代謝的影響.pdf

1、目的:1.通過銅負荷飲食法建立裸鼠的肝臟銅代謝異常疾病模型，分離同種裸鼠肝細胞懸液，予以腹腔內(nèi)移植，研究肝細胞移植對裸鼠銅代謝的影響;2.通過檢測脂質(zhì)過氧化物質(zhì)細胞色素P450(cytochrome protein P450，CYP450)、肝丙二醛(MDA)、裸鼠肝組織氧活性簇(ROS)及超氧化物歧化酶(SOD)的變化，探討移植肝細胞影響裸鼠肝銅代謝的可能機制。
　　方法:1.裸鼠肝臟銅代謝異常疾病模型的建立:裸鼠（4周齡，體重

2、23±2.3g），于SPF級無菌動物飼養(yǎng)房正常飼養(yǎng)10天適應(yīng)環(huán)境后，采用銅飲食負荷法造模，喂飼混有硫酸銅1.0g/kg的飼料和0.185％的硫酸銅水4周。通過代謝籠收集裸鼠24小時尿液測定尿銅值，抽血做肝功能檢測來評價模型的建立。2.實驗分組:將40只裸鼠肝銅代謝異常模型隨機分為2組，肝細胞移植組（組1）及腹腔肝細胞培養(yǎng)液注射組（組2），每組各20只。取20只未造模裸鼠（同齡正常飲食飲水裸鼠）行肝細胞移植做正常代謝對照組（組3）。另取4

3、0只同齡裸鼠作1對1肝細胞移植的供體。3.裸鼠移植肝細胞懸液制備及實驗干預(yù)。4.實驗檢測:分別在細胞移植前1h，移植后3d，7d，14d，28d對三組裸鼠心臟穿刺抽血0.1ml行肝功(ALT、ALB、AST)檢測、血清銅(serumcopper)含量測定、血清銅藍蛋白(ceruloplasmin，CP)測定。在術(shù)后7天、28天分別對3組裸鼠行活檢取部分肝組織，所取肝組織制成細胞勻漿檢測肝臟銅含量，ELISA測細胞色素P4502E1蛋白表

4、達變化，肝組織勻漿的SOD活性，肝組織MDA含量，肝組織活性氧簇(ROS)濃度變化。移植后28天時行肝組織和移植細胞活檢，肝組織以10％的福爾馬林溶液固定，石蠟包埋切片，采用HE染色后，于光學(xué)顯微鏡下行病理學(xué)檢測及肝銅染色。
　　5.統(tǒng)計學(xué)分析
　　計量資料使用均數(shù)±標準差描述，計數(shù)資料采用率和構(gòu)成比描述;兩組間的比較采用t分析;檢驗水準(a)設(shè)定為0.05，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。三組間比較采用方差設(shè)計，檢驗水準

5、(a)設(shè)定為0.05，P＜0.05，上述統(tǒng)計分析均由SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行。
　　結(jié)果:1.通過銅負荷飲食后，建模組血清銅（4.38±0.17μg/ml）明顯高于正常喂養(yǎng)組（1.05±0.05μg/ml）（P＜0.05），建模組尿銅數(shù)值（137.6±13.4μg/24h）明顯高于正常喂養(yǎng)組尿銅值(25.5±6.1μg/24h)（P＜0.05）。銅過量負荷后，建模組肝功檢測ALT、AST數(shù)值明顯高于正常喂養(yǎng)組(P＜0.05)，

6、建模組蛋白合成水平ALB低于較正常喂養(yǎng)組（P＜0.05）。
　　2.裸鼠移植肝細胞懸液制備良好，光鏡下見典型肝細胞特征，臺盼藍染色細胞活性大于90％。術(shù)后三組裸鼠于28d活檢時均無死亡。28天活檢時候可見組1、組3裸鼠腹腔內(nèi)生長的肝細胞團塊，細胞團塊活檢HE染色于光鏡下可見肝細胞生長良好。
　　3.術(shù)前、術(shù)后組1、組2各時間點AST、ALT、血清銅均明顯高于組3，蛋白合成水平及血清銅藍蛋白含量均低于組3，有顯著差異性（P＜0

7、.05）。移植術(shù)前1h組1裸鼠AST、ALT、ALB、血清銅、血清銅藍蛋白檢測結(jié)果與組2比較無明顯差異性（P＞0.05），組1術(shù)后3d，7d、14d、28d時AST、ALT、ALB、血清銅、肝銅藍蛋白檢測結(jié)果與組2比較有顯著差異性（P＜0.05）。術(shù)后28d所測組1肝銅含量（35.97±1.45μg/g）明顯低于組2肝銅水平（53.30±3.17μg/g）(P＜0.05)。
　　4.裸鼠肝組織病理學(xué)檢測:干預(yù)后28d，組1肝組織肝

8、細胞結(jié)構(gòu)略顯混亂，輕微水腫，肝細胞呈條索狀排列，可見少量點狀壞死肝細胞，少量肝細胞核濃縮深染，有的細胞核溶解消失。組2可見自身肝臟肝細胞出現(xiàn)腫脹、氣球樣變、脂肪樣變，肝細胞內(nèi)缺少胞漿存在，代之以大小不等的空泡，肝細胞核被推向細胞周圍或居中央而壞死消失。組3細胞結(jié)構(gòu)完整，相鄰的肝板相互吻合連接，可見所取標本肝細胞組織結(jié)構(gòu)正常，中央靜脈清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，胞質(zhì)、胞核完整，肝細胞無明顯病變表現(xiàn)。采用紅氨酸

9、銅染色法對28d組1，組2肝臟切片進行銅染色。組1的肝細胞內(nèi)銅顆粒沉積明顯少于組2。
　　5.干預(yù)后28d，組1 CYP4502E1水平(0.95±0.02 nmol/mg)低于組2水平(2.41±0.06 nmol/mg)(P＜0.05)，組1 MDA含量(4.25±0.14 nmol/mg)低于組2水平(7.72±0.10 nmol/mg)(P＜0.05)，組1 ROS含量(11.28±1.26nmo1/mg)低于組2水平(2