脂肪基質(zhì)細(xì)胞移植對(duì)裸鼠后肢缺血治療作用的分子影像研究.pdf

1、研究背景和目的
　　外周動(dòng)脈疾?。╬eripheralarterialdisease，PAD）以下肢動(dòng)脈阻塞為特點(diǎn)，在老齡、吸煙、動(dòng)脈粥樣硬化和糖尿病人群中患病率極高。嚴(yán)重PAD患者多無外科或介入血運(yùn)重建術(shù)的適應(yīng)證，且長(zhǎng)期預(yù)后不良。大量研究證實(shí)骨髓來源的干、祖細(xì)胞移植有助于促進(jìn)缺血肢體的血管生成，改善側(cè)支代償和血流灌注，為PAD治療帶來新的希望。然而，骨髓作為最常見的細(xì)胞來源，其足量獲取存在一定的局限；此外，組織學(xué)等常規(guī)方法難以實(shí)

2、現(xiàn)對(duì)體內(nèi)移植細(xì)胞的連續(xù)監(jiān)測(cè)，因此不足以闡明細(xì)胞移植的確切治療效果。
　　本實(shí)驗(yàn)以前期研究為基礎(chǔ)，選取β-Actin-luc轉(zhuǎn)基因小鼠的脂肪組織為細(xì)胞來源，首先嘗試體外培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)螢火蟲熒光素酶（fireflyluciferase，F(xiàn)luc）報(bào)告基因的脂肪基質(zhì)細(xì)胞（adiposederivedstromalcells，ADSCs），并建立無胸腺裸鼠后肢缺血的PAD動(dòng)物模型。然后，將體外培養(yǎng)的ADSCs移植入PAD模型裸鼠的缺血后肢進(jìn)

3、行治療，并運(yùn)用報(bào)告基因Fluc生物發(fā)光成像對(duì)ADSCs進(jìn)行在體無創(chuàng)示蹤，評(píng)價(jià)ADSCs的體內(nèi)轉(zhuǎn)歸；同時(shí)采用激光多普勒血流成像等方法監(jiān)測(cè)缺血后肢的血流灌注與血管生成。研究旨在為ADSCs對(duì)PAD肢體缺血的治療作用提供進(jìn)一步證據(jù)。
　　研究方法
　　FVB來源的β-Actin-luc轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖后進(jìn)行生物發(fā)光成像，篩選出Fluc陽性子代繼續(xù)繁殖，直至穩(wěn)定攜帶該報(bào)告基因。無菌分離攜帶β-Actin-luc小鼠的脂肪組織，采用改良

4、膠原酶消化法，分離出脂肪組織中的基質(zhì)血管部分，使用常規(guī)間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（MSC）培養(yǎng)基進(jìn)行體外培養(yǎng)，取貼壁細(xì)胞為原代ADSCs，繼續(xù)消化傳代。收集第3代ADSCs，采用CD44-PE、CD34-PE、CD31-PE、CD45-PE、CD90-APC單克隆抗體進(jìn)行免疫表型的流式細(xì)胞學(xué)鑒定。運(yùn)用體外生物發(fā)光成像鑒定ADSCs的Fluc表達(dá)；進(jìn)一步將ADSCs（1×106）植入無胸腺BALB/c裸鼠的后肢肌肉中，鑒定細(xì)胞的體內(nèi)生物發(fā)光情況。

5、r>　　PAD模型建立于雄性無胸腺BALB/c裸鼠（n=40），采用結(jié)扎裸鼠單側(cè)股動(dòng)脈近端和遠(yuǎn)端，并移除兩端之間的股動(dòng)脈節(jié)段及其所有分支的方法。PAD模型裸鼠隨機(jī)分為ADSCs組（n=20）或PBS組（n=20），分別將體外擴(kuò)增的ADSCs（1×106）或PBS注入裸鼠的缺血后肢肌肉中，同時(shí)設(shè)立不行股動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)的空白對(duì)照組（n=10），或僅分離而不結(jié)扎股動(dòng)脈的假手術(shù)組（n=10）。運(yùn)用Fluc生物發(fā)光成像對(duì)體內(nèi)ADSCs進(jìn)行示蹤，激光多

6、普勒血流灌注成像（LDPI）用于監(jiān)測(cè)缺血肢體的微循環(huán)血流變化，采用自身對(duì)照和相對(duì)LDPI指數(shù)定量。免疫組織化學(xué)法用于檢測(cè)血管生成情況，同時(shí)計(jì)算裸鼠發(fā)生跛行、自截肢的百分率。
　　研究結(jié)果
　　報(bào)告基因光學(xué)成像顯示，篩選繁殖出的轉(zhuǎn)基因小鼠近交系穩(wěn)定攜帶β-Actin-luc，由其脂肪組織中分離培養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)CD90（98.9％）及CD44（89.7％）等MSC的表面標(biāo)志，而CD45、CD34和CD31呈現(xiàn)無或低表達(dá)（<5

7、.0％），證實(shí)ADSCs具有MSC的表型特點(diǎn)。生物發(fā)光成像證實(shí)，體外培養(yǎng)的ADSCs其細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量與Fluc平均輻射度成正直線相關(guān)關(guān)系（相關(guān)系數(shù)r2=0.94）。裸鼠后肢肌肉內(nèi)移植的ADSCs，其Fluc平均輻射度在熒光素腹腔注射后0-42min內(nèi)先迅速增強(qiáng)后平緩減弱，21min時(shí)最強(qiáng)，達(dá)（6.92×106±4.11×105）P·s-1·cm-2·sr-1。
　　PAD模型建立后，裸鼠缺血后肢與空白對(duì)照組、假手術(shù)組對(duì)應(yīng)的后肢相比

8、，LDPI指數(shù)明顯降低，表明所采用術(shù)式具有良好的血流阻斷效果。體內(nèi)生物發(fā)光成像證實(shí)，在細(xì)胞移植后35天內(nèi)，ADSCs組裸鼠的缺血后肢均顯示Fluc生物發(fā)光信號(hào)，平均輻射度最強(qiáng)達(dá)（6.59×106±1.02×106）P·s-1·cm-2·sr-1，第35天減弱至（2.50×105±1.66×105）P·s-1·cm-2·sr-1，表明ADSCs可在缺血后肢移植后的有限時(shí)間內(nèi)存活，但數(shù)量逐漸減少。LDPI成像監(jiān)測(cè)顯示，細(xì)胞移植后ADSCs組

9、和PBS組缺血后肢的相對(duì)LDPI指數(shù)均逐漸增強(qiáng)，跛行情況改善，但ADSCs組更為顯著（P<0.05），證實(shí)ADSCs移植較PBS可進(jìn)一步改善缺血后肢的微循環(huán)血流灌注，并改善患肢跛行，減少自截肢的發(fā)生。缺血肢體肌肉組織的CD31染色表明，ADSCs組具有更高的毛細(xì)血管密度。
　　研究結(jié)論
　　1.β-Actin-Fluc轉(zhuǎn)基因FVB小鼠脂肪組織中分離的基質(zhì)細(xì)胞（ADSC）高表達(dá)MSC的表面標(biāo)志，可在體外和移植后穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告基因